[發明專利]對PCSK9基因中的識別序列具有特異性的工程化大范圍核酸酶

有效

• 申請號: 201880038349.0
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN110769845B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: V·巴爾特斯維克;D·揚茨;J·J·史密斯;J·萊普
• 申請（專利權）人: 精密生物科學公司
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61K48/00;C12N9/22;C12N15/63
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;徐志明

本發明包括工程化大范圍核酸酶，其識別和切割人PCSK9基因內的識別序列。本發明還包含用于在藥物組合物中和在用于治療或減輕膽固醇相關障礙(例如高膽固醇血癥)的癥狀的方法中使用這種工程化大范圍核酸酶的方法。此外，本發明包括包含工程化大范圍核酸酶蛋白、編碼工程化大范圍核酸酶的核酸的藥物組合物以及這種組合物用于治療與膽固醇相關障礙例如高膽固醇血癥的用途。

技術領域

本發明涉及分子生物學和重組核酸技術領域。特別地，本發明涉及對PCSK9基因內的識別序列具有特異性的工程化大范圍核酸酶。這種工程化大范圍核酸酶可用于治療心血管疾病和高膽固醇血癥(包括常染色體顯性家族性高膽固醇血癥)的方法中。

通過EFS-WEB作為文本文件提交的序列表的引用

本申請包含序列表，其已經通過EFS-Web以ASCII格式提交，并且將其全部內容按引用并入本文中。2018年4月20日創建的所述ASCII拷貝命名為P109070022WO00-SEQTXT-MJT，并且大小為89,660字節。

背景技術

與高水平的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)相關的心血管疾病是發達國家中的主要死亡原因，而LDL-C水平升高是冠狀動脈疾病(CHD)和動脈粥樣硬化斑塊形成的主要危險因素。例如，家族性高膽固醇血癥(FH)是特征在于高膽固醇水平，尤其是高LDL-C水平，以及發生早發性CHD的遺傳障礙。雜合型FH患者通常用降血脂藥(如他汀類藥物)治療，這些藥物降低總膽固醇水平和特別是LDL-C水平。事實上，他汀類藥物的使用已大大降低了某些患者人群中的心血管疾病的風險。但是，某些患者人群，特別是具有純合形式FH的那些人群，無法響應于藥物治療(包括高劑量他汀類藥物)而實現正常的LDL-C水平。

降脂領域的重大進步是靶向原蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)的療法的開發。人PCSK9基因位于染色體1p32.3上，長度為25,378bps。它包含編碼692個氨基酸的12個外顯子。PCSK9蛋白包含信號肽、前結構域、催化結構域和C末端富含半胱氨酸-組氨酸的結構域，其由3個模塊(M1、M2和M3)組成。

盡管PCSK9在胃腸道、腎臟和中樞神經系統(CNS)中的表達水平較低，PCSK9的合成、分泌和表達主要在肝臟中發生。PCSK9前體蛋白的分子量為75kDa。在內質網(ER)中自動催化裂解后，PCSK9前結構域與62kDa的成熟PCSK9蛋白分離。分離的前結構域仍與成熟的PCSK9蛋白保持非共價結合，形成前片段(prosegment)-PCSK9復合物，其迫使PCSK9催化結構域變為非活性構象。然后切割的復合物從ER轉運至高爾基器并釋放。在肝臟細胞中，分泌的PCSK9與肝細胞膜上的LDL受體結合。這種結合通過PCSK9催化結構域和前結構域分別與LDL受體的表皮生長因子樣重復同源結構域A(EGF-A)和β-推進器結構域(propellerdomain)的相互作用介導。

LDL受體通常將細胞外液中的脂肪分子(包括膽固醇)轉運到細胞中，從而降低循環LDL濃度。在不存在PCSK9的情況下，LDL受體-配體復合物發生構象變化，其允許LDL的細胞內傳遞以及LDL受體重循環回到細胞表面。但是，PCSK9與LDL受體的結合阻止了復合物的這種構象變化，并將該受體引導至溶酶體進行降解。結果，較少的LDL受體存在于細胞表面上，這隨之增加血流中的循環LDL膽固醇水平。除LDL受體外，PCSK9還顯示介導相同家族中的其他脂質受體的降解，包括極低密度的脂蛋白(VLDL)受體、載脂蛋白E受體2和LDL受體相關蛋白1。

連同編碼LDL受體和載脂蛋白B的基因，PCSK9是與常染色體顯性形式的FH相關的第三個基因。在常染色體顯性FH中，PCSK9基因中的功能獲得性突變進一步降低LDL受體在細胞表面的定位，并已與LDL膽固醇水平升高相關。有趣的是，已觀察到在具有低LDL膽固醇水平和顯著降低的心血管事件發生率的受試者中發現了PCSK9中的功能喪失性突變。此外，PCSK9功能喪失的患者顯示出對他汀類治療的反應升高。