[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增免疫細(xì)胞的方法及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880007383.1
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN110234756A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 格雷戈里·伊恩·弗羅斯特;詹姆斯·約瑟夫·奧努弗
• 申請（專利權(quán)）人: F1腫瘤醫(yī)學(xué)公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京東方億思知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11258
• 代理人: 肖善強(qiáng)

1.一種用于從分離血液中轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞的方法，其包括：

a)富集外周血單核細(xì)胞(PBMC)以從分離血液中分離包含T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞的PBMC；

b)在封閉系統(tǒng)的腔室內(nèi)在有效條件下活化所分離的PBMC的T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞，其包含有效量的抗CD3抗體和/或有效量的抗CD28；

c)在有效條件下用非復(fù)制勝任型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)所活化的T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞，從而產(chǎn)生遺傳修飾的T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞；以及

d)在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中將所述遺傳修飾T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞擴(kuò)增至超過150ml的體積以及選自如下的擴(kuò)增完成選擇標(biāo)準(zhǔn)：乳酸濃度超過10mM、至少10倍擴(kuò)增T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞、和在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中至少4天，其中所述活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增在所述腔室內(nèi)進(jìn)行，而不在所述活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增之間或期間洗滌所述細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述擴(kuò)增期間的任何時間進(jìn)行所述擴(kuò)增，而不除去超過10％的所述細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增在同一腔室中進(jìn)行，而不在所述活化和在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中至少7天擴(kuò)增所述T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞之間從所述腔室除去所述T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中存在的N-乙酰半胱氨酸比在進(jìn)行所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)混合物中多至少5mM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，超過存在于進(jìn)行所述活化的活化反應(yīng)混合物中1/100的有效量的抗CD3抗體和/或抗CD28抗體存在于所述細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述活化步驟的有效條件包括所分離的PBMC的濃度為5×10⁴個PBMC/ml和4×10⁶個PBMC/ml之間。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述擴(kuò)增后，存在的細(xì)胞數(shù)量是所述活化步驟期間存在的PBMC數(shù)量的50倍至150倍。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述活化和所述擴(kuò)增在有效量的IL-2存在下發(fā)生。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，IL-2的所述有效量在25IU/ml和299IU/ml之間。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，以低于300國際單位/ml的濃度存在IL-2用于所述活化和擴(kuò)增。

11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，在所述擴(kuò)增開始時在所述細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中存在IL-2，并在所述擴(kuò)增期間將IL-2加入所述細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基至少兩次。

12.根據(jù)權(quán)利要求8-11中任一項所述的方法，其中，在所述擴(kuò)增步驟期間在所述細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中存在IL-7。

13.根據(jù)權(quán)利要求8-12中任一項所述的方法，其中，所述T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞從所述活化步驟中的T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞的數(shù)量擴(kuò)增至少20倍。

14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述非復(fù)制勝任型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒各自包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含與在T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞中有活性的啟動子可操作地連接的一個或多個核酸序列，其中所述一個或多個核酸序列的第一核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，所述CAR包含：

a)抗原特異性靶向區(qū)(ASTR)，

b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

c)細(xì)胞內(nèi)活化結(jié)構(gòu)域。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述ASTR是微環(huán)境限制的ASTR。