[發明專利]一種測定人全血中5種免疫抑制劑類藥物濃度的方法

在審

• 申請號: 202111165782.0
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113933419A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 謝永明;劉喜艷;王俊霞
• 申請（專利權）人: 上海中科新生命生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 肖平安

本發明提供一種測定人全血中5種免疫抑制劑類藥物濃度的方法，屬于免疫抑制劑類藥物檢測技術領域，其先對待測樣本、質控品樣本和標準品樣本進行液相色譜串聯質譜檢測的前處理，前處理過程中，使用硫酸鋅作為沉淀劑，前處理后的各樣本分別進行液相色譜串聯質譜檢測，同時準確定量分析全血中5種免疫抑制劑類藥物，本發明提供的測定方法具有準確度好、靈敏度高、精密度高、成本低且通量高的優點。

技術領域

本發明屬于免疫抑制劑類藥物檢測技術領域，具體涉及一種基于LC-MS/MS技術對人全血中5種免疫抑制劑類藥物濃度同時定量分析的方法。

背景技術

免疫抑制劑是一類可抑制機體異常免疫反應的藥物，通過抑制淋巴細胞的功能，減少移植物排斥反應的發生，延長移植物存活時間。免疫抑制劑由于不良反應較多，常常需要在低劑量發生移植物排斥和高劑量產生毒性之間取得平衡。臨床常用的免疫抑制劑如環孢霉素A、霉酚酸酯、他克莫司、西羅莫司、依維莫司等。不同的免疫抑制劑作用于淋巴細胞激活的不同時期，可發揮協同作用。目前臨床上也多采用聯合用藥的方法來提高治療方案的整體有效性和安全性。這類藥物血藥濃度與免疫抑制的程度有關，也與肝腎的毒性密切相關，由于其治療窗窄，其藥動學存在明顯的個體間差異，因此需要密切監測藥物濃度，以確保處于安全有效的治療范圍。

對免疫抑制劑的TDM已是臨床常規工作，免疫法、高效液相色譜法(HPLC-UV)和液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)是最常用的TDM方法，其中免疫法以抗原抗體結合為檢測的基礎，市場有專用儀器及商品化試劑盒，具有自動化程度高、操作簡便、快速的特點，但由于與抗原結構相似的物質如藥物的代謝物，可競爭性與抗體結合，從而影響結果準確度。高效液相色譜法對免疫抑制劑的檢測，需經復雜的前處理過程去除干擾物質，操作繁瑣，成本增加，且需特殊技術和昂貴設備，不適合常規檢測。

近年來，液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)在免疫抑制劑的檢測中被廣泛使用，其特異性高、運行時間短并可以同時測定分析多種化學結構。現有方法大多數通量小，影響了檢測的效率，無法滿足臨床需求。部分方法采用外標法測定免疫抑制劑類藥物濃度，存在基質效應，不能準確定量，因此要結合臨床需求，開發合理的方法。

免疫抑制劑TDM的生物樣本包括血漿與全血。其中鈣調磷酸酶抑制劑包括環孢霉素A和他克莫司，兩者在體內均大部分與紅細胞結合，西羅莫司同樣主要分布于血細胞，臨床常規監測采用全血標本，血漿中分布很少。MMF是霉酚酸的酯類衍生物，MMF口服后在體內迅速水解為活性代謝產物霉酚酸，霉酚酸臨床主要用血漿標本測定藥物濃度，采用全血樣本監測霉酚酸的報道不多。綜合考慮，采用全血作為臨床檢測樣本。但是全血成分復雜，含有大量的內源性大分子，使得分析結果易受基質效應的影響，因此在分析前需要對樣本進行適當的預處理，以降低基質效應的影響。常見的有機溶劑沉淀蛋白并不能完全去除雜質，影響提取效率和準確定量，長期使用易對操作人員和環境造成不可逆損害，并且增加了檢測成本；目前常用的液液萃取和固相萃取法，復雜性操作延長了前處理時間，增加樣本處理成本。并且現有技術中多采用五氟苯基柱，使用壽命短，增加了檢測成本。

發明內容

基于現有技術中存在上述問題，本發明提供一種測定人全血中5種免疫抑制劑類藥物濃度的方法，其前處理步驟簡單快捷，具有準確度好、靈敏度高、精密度高、成本低且通量高的優點。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種測定人全血中5種免疫抑制劑類藥物濃度的方法，先對待測樣本進行液相色譜串聯質譜檢測的前處理，前處理后的各樣本分別進行液相色譜串聯質譜檢測，同時準確定量分析全血中5種免疫抑制劑類藥物；所述的液相色譜串聯質譜檢測中，質譜采用多反應監測，化合物MRM參數如下：

采用ESI離子源、正離子模式分段掃描分析。

根據以上方案，所述的前處理過程中，使用硫酸鋅作為沉淀劑。