[實用新型]肺孢子菌LAMP特異性檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201320561332.8
• 申請日: 2013-09-10
• 公開（公告）號: CN203833934U
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 張楠;安春麗;王曉黎;秦錚;國九英;馬素麗;樊華;趙亞濱
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 宋鐵軍

技術領域

本實用新型涉及生物應用領域，特別涉及一種肺孢子菌LAMP特異性檢測試劑盒，適用于肺孢子菌肺炎臨床檢測。

背景技術

肺孢子菌肺炎（Pneumocystis?pneumonm，PCP)是一種嚴重的致死性肺炎。不僅常見于艾滋病及其他各類先天或后天免疫機能受損者，而且與慢性阻塞性肺病、肺囊性纖維變以及間質性肺炎等危害嚴重的呼吸系統疾病的發生密切相關。隨著艾滋病蔓延、免疫抑制劑的廣泛應用、慢性阻塞性肺病等呼吸系統疾病的日趨增多，PCP在臨床上逐步成為“常見病”，已經引起醫學界廣泛重視。PCP一旦發生，病情進展迅速，不經治療幾乎100％死亡。而早期及時的治療，治愈率可達80%。因此，早期診斷和治療對患者的預后極為重要。由于PCP的臨床表現和體征不具特異性，必須依賴實驗室的病原學檢查進行診斷。然而，因孢子菌寄生部位的特殊性，使其病原學檢測方法受到取材及陽性率低等方面的限制，缺乏臨床適用性。聚合酶鏈反應（PCR）等基因檢測技術被認為是診斷肺孢子菌感染的最有希望的方法之一。但是，經典的及一些改良的PCR方法因其對設備要求高，操作過程復雜等缺點，難以在臨床診斷中廣泛推廣應用。環介導等溫擴增（loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）技術，是近年來開發的一種新的核酸擴增方法，其原理是針對靶基因的6個區域設計3對特異性引物，在一種特殊的鏈置換DNA聚合酶（BstDNA?polymerase）的作用下發生DNA鏈的置換和環化，恒溫水浴（65℃左右）30-60分鐘即可完成109-1010拷貝的擴增。其最低敏感檢測極限是10個拷貝，比PCR高幾個數量級。而且，LAMP技術不像PCR和實時定量PCR那樣需要昂貴的儀器，只需要普通水浴箱即可。因此，與其他檢測方法相比，LAMP方法有擴增快速、結果易于觀察、設備簡單、敏感性和特異性高等優點，適于基層臨床應用。目前，LAMP技術正在被廣泛應用于某些疾病的流行病學調查以及某些熱帶病的檢測、診斷中。在日本被衛生組織認可并開發利用LAMP的檢測試劑盒有八種：檢測SARS冠狀病毒，結核分枝桿菌，肺炎支原體，軍團菌，A型流感病毒，H1，H5流感病毒，人類乳頭狀瘤病毒等。但是，目前尚缺乏LAMP技術檢測肺孢子菌感染的可靠技術和可供臨床應用的檢測試劑盒。

發明內容

本實用新型是克服現有技術不足，提供一種特異性強、敏感性高、快速、廉價并且操作簡單的肺孢子菌LAMP特異性檢測試劑盒，為檢測肺孢子菌肺炎提供了技術保證，也有望成為臨床檢測肺孢子菌肺炎的主要方式。

一種用于肺孢子菌LAMP特異性檢測試劑盒，其特征在于：包括甜菜堿試劑瓶、dNTPs試劑瓶、緩沖液試劑瓶、氯化鎂試劑瓶、引物試劑瓶、聚合酶試劑瓶、超純水試劑瓶、熒光指示劑、熒光顯色液、陽性對照品、陰性對照品、試劑盒殼體和試劑瓶固定塊，甜菜堿試劑瓶、dNTPs試劑瓶、緩沖液試劑瓶、氯化鎂試劑瓶、引物試劑瓶、聚合酶試劑瓶、超純水試劑瓶、熒光指示劑、熒光顯色液、陽性對照品、陰性對照品固定在試劑瓶固定塊上，試劑瓶固定塊固定于試劑盒殼體內。

所述的試劑盒殼體形狀為長方體或其他形狀，所使用的材料為紙板或其他材料，其打開方式為繞轉軸打開，或其它打開形式，其閉合后固定方式為搭扣形式，或其它固定形式。

所述的試劑瓶固定塊所能固定試劑瓶數量等于或者大于1，形狀為長方體，或是其它形狀，所使用的材料為海綿，或使用其它材料，固定試劑瓶的方式為依靠摩擦力固定，或其它固定方式。

肺孢子菌LAMP特異性檢測試劑盒的使用方法包括如下使用步驟：

1）配置反應體系。從試劑盒中取出甜菜堿試劑瓶、dNTPs試劑瓶、緩沖液試劑瓶、氯化鎂試劑瓶、引物試劑瓶、聚合酶試劑瓶、超純水試劑瓶，將溶液加入反應容器內，在反應容器內加入熒光指示劑、熒光顯色液，將被檢測模板加入反應容器；

2）LAMP擴增反應。將反應容器置于一定溫度環境內反應一段時間；

3）結果檢測。使用儀器檢測反應擴增曲線（步驟1中使用熒光指示劑），或觀察容器內顏色變化（步驟1中使用熒光顯色液）判斷檢測結果；

4）陽性對照品、陰性對照品使用時，替代步驟1中的被檢測模板。

本實用新型通過比較人源肺孢子菌(P.jirovecii)和大鼠源肺孢子菌(P.carinii、P.wakefieldiae)的核酸序列，選取核糖體小亞基一段保守序列，根據此序列設計特異性引物：

F3????5，-ATCAGATACCGTCGTAGTCTTA-3，