[發明專利]一種基于gp120/CCR5阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法

有效

• 申請號: 201811653600.2
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109652454B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 范春雷
• 申請（專利權）人: 杭州邁爾德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 北京工信聯合知識產權代理有限公司 11266
• 代理人: 商琛

本發明建立了一種基于gp120/CCR5阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法：將紅色熒光蛋白tagRFP偶聯于gp120蛋白羧基末端(C端)，構建真核表達載體，并制備gp120?tagRFP融合蛋白；將人源CD4蛋白基因構建在CMV啟動子下；將人源CCR5基因構建在CMV啟動子下游，將綠色熒光蛋白基因d2EGFP構建在NF?κB RE?TATA?like人工復合調控元件的下游，兩者構建于同一個慢病毒載體內；并建立新型的穩轉細胞系CD4.CCR5.CCR5.NF?κBR?d2EGFP/Jurkat；以gp120?tagRFP與細胞系的親和進行熒光檢測篩選阻斷劑。本方法可精確反映抗CCR5藥的效應，并可同時獲得阻斷功能與CC趨化因子/CCR5信號通路的生物學效應數據，構建了快速篩選抗CCR5藥物和評估其生物學效應的實驗模型。

技術領域

本發明涉及一種基于gp120/CCR5靶點及其生物效應的藥物快速篩選方法，屬于生物技術領域。

背景技術

目前已有幾十種抗HIV-1藥物得到美國食品與藥品監督管理局(FDA)批準，其類型包括逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、CCR5受體抑制劑、整合酶抑制劑、以及融合抑制劑等。然而，已被批準的藥物中沒有一種是可以完全抑制病毒感染的，而且由于HIV-1突變株的產生，大部分均對不同類型的拮抗劑具有耐藥性。此外，隨著對病毒入侵過程的深入了解，研究者發現，大多數的HIV都是通過與CCR5或CXCR4結合來感染宿主細胞。通過病毒表面的包膜糖蛋白gp120與T細胞表面受體CD4和趨化因子受體CCR5或CXCR4相互作用進入宿主細胞，是人類免疫缺陷病毒(HIV)致病的關鍵。因而，輔助受體CCR5是目前抗HIV-1感染的首選靶點，CCR5拮抗劑做為抗HIV-1感染藥物的研發成為熱門。CCR5拮抗劑包括趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體、肽類化合物等4類。因此，建立一個高效、快速、簡便、精確的高通量篩選系統非常重要，但目前為止尚未見有關報道。本發明在于建立一個基于gp120/CCR5阻斷功能及其生物效應的抗HIV-1感染藥物的高效、快速、簡便、精確的高通量篩選系統。

發明內容

本發明的目的是建立了一種基于gp120/CCR5阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法。

本發明構思如下：

采用紅色熒光蛋白tagRFP偶聯于gp120蛋白羧基末端，將該熒光蛋白標記基因構建載體并在細胞內表達，制備融合蛋自；將人源CD4基因克隆到真核表達載體CMV啟動子下，構建表達質粒；將人源CCR5基因構建在CMV啟動子下，將綠色熒光蛋白基因d2EGFP構建在NF-κB RE-TATA-like人工復合調控元件的下游，兩者構建于同一個慢病毒載體內，獲得高表達CCR5和調控表達報告基因質粒；二個基因共轉染Jurkat細胞，建立穩轉細胞系。將CCR5拮抗劑包括趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體、肽類化合物等新藥與CD4.CCR5.NF-κ B RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat細胞共孵育后再與gp120-tagRFP熒光蛋白融合蛋白一起共孵育；同時設立穩轉細胞與gp120-tagRFP熒光蛋白融合蛋白直接共孵育的對照組，清洗非特異性結合后檢測熒光值。將CD4.CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat細胞與CC趨化因子試劑和篩到的具有gp120/CCR5阻斷功能的CCR5拮抗劑共孵育為實驗組；同時設立CD4.CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat細胞與CC趨化因子試劑共孵育為對照組，設立不做任何處理的CD4.CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat細胞為空白組，清洗非特異性結合后檢測熒光值。通過檢測紅色熒光蛋白tagRFP熒光值判斷該抗CCR5藥是否具有gp120/CCR5阻斷功能；通過檢測綠色熒光蛋白d2EGFP熒光值并與對照組比較，判斷抗CCR5藥是否影響CC趨化因子/CCR5的正常生物學效應。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種基于gp120/CCR5阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法，包括以下步驟：