[發明專利]2-酮基-L-古龍酸的發酵用培養基及2-酮基-L-古龍酸的發酵生產方法

有效

• 申請號: 201811626312.8
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109593813B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 司振軍;李喬平;胡柏剡;朱永強;李宏軒;俞柏金;陳召峰;于凱;呂國鋒;黃國東
• 申請（專利權）人: 黑龍江新和成生物科技有限公司;上虞新和成生物化工有限公司;浙江新和成股份有限公司
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P7/60;C12N1/20;C12N1/38;C12R1/11;C12R1/085;C12R1/125;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

本發明提供了一種2?酮基?L?古龍酸的發酵用培養基，其含有0.007～0.009g/L的混合營養劑，所述混合營養劑重量百分比組成為：25～67％的細胞色素C和33～75％的血紅素。本發明還提供一種2?酮基?L?古龍酸的發酵生產方法，通過在發酵培養基中的混合營養劑濃度降至0.001～0.003g/L時補充加入所述混合營養劑，以維持其濃度在0.001～0.003g/L直至發酵結束，或者當在線溶氧值為20％～40％時補充加入吡咯喹啉醌使其在培養基中的濃度為0.003～0.005g/L，均可以縮短發酵周期、提高2?酮基?L?古龍酸的合成效率。

技術領域

本發明屬于微生物發酵技術領域，更具體地，本發明涉及一種新型的2-酮基-L-古龍酸的發酵用培養基及2-酮基-L-古龍酸的發酵生產方法，使用該培養基和發酵生產方法可以提高2-酮基-L-古龍酸的合成效率、縮短發酵周期。

背景技術

維生素C(Vitamin C，簡稱VC)，即L-抗壞血酸(L-Ascorbic acid)，是人體必須從外界攝入的一種水溶性維生素，在醫藥、食品、化妝品、飼料等領域應用廣泛。2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，簡稱2-KGA)是合成維生素C的重要前體，目前“二步發酵法”依然是工業化生產VC的主要工藝，其中第二步混菌發酵是該工藝的關鍵技術，該技術只有在大菌(或伴生菌)的營養輔助下，小菌才能夠正常生長代謝，合成相關的酶。其次，小菌利用細胞膜上的山梨糖脫氫酶將山梨糖轉化為山梨酮，接著在山梨酮脫氫酶作用下將山梨酮轉化為2-KGA，同時將從山梨糖和山梨酮脫下的電子經細胞膜上的電子傳遞鏈傳遞給氧氣形成氧負離子，氧負離子與來源于山梨糖和山梨酮的氫離子結合，最終生成水。因此在該發酵工藝中，通過提高酶活與電子傳遞的效率來提高2-KGA的合成效率是非常必要的。

關于酶活的提高，專利文獻1發現Fe³⁺、Mg²⁺和Ca²⁺能有效提高L-山梨糖脫氫酶和L-山梨酮脫氫酶的活性，但Cu²⁺則抑制L-山梨酮脫氫酶活性，過量的Cu²⁺導致發酵過程中巨大芽孢桿菌(B.megaterium)自溶，從而影響2-KGA的產量，而添加Mg²⁺和Mn²⁺則能有效抑制這一現象。因此，專利文獻1通過在培養基中適當添加這些金屬離子有效控制酶活而實現提高2-KGA產量的目的。

專利文獻2也對培養基進行優化，通過添加還原型谷胱甘肽使菌體抵抗滲透壓和維持體內正常的氧化還原環境的能力，促進混菌體系更好的適應發酵環境，提高酮古龍酸菌生物量。專利文獻3則在大小菌全基因組的測序與功能注釋的基礎上，對大小菌糖代謝網絡進行分析，發現并驗證了一批可以在混菌發酵過程中被小菌很好利用并具有促進菌體生長的廉價碳源，如乙醇、乙醛及乙酸(鹽)、D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖等。

關于電子傳遞效率的提高，專利文獻4發現硫辛酸作為輔酶或輔基的組成成分，通過行使偶聯酰基轉移和電子轉移的功能，在物質代謝中起重要作用。因此專利文獻4通過在培養基中補充這種營養因子來提高酮古龍酸菌的生長和產酸能力。

現有技術文獻：

專利文獻1：CN101402988A

專利文獻2：CN102424830A

專利文獻3：CN104357529A

專利文獻4：CN102321698B

發明內容

發明要解決的問題

本發明人對山梨糖代謝途徑生產2-KGA進行了潛心研究，試圖找到新的有效控制酶活和電子傳遞效率的關鍵物質，并利用該物質優化培養基和改進發酵生產方法。