[發(fā)明專利]一種高通量構(gòu)建單克隆抗體表達(dá)載體的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811618124.0
• 申請(qǐng)日: 2018-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN111378671A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙新燕;盧士強(qiáng);趙東霞;劉小青;鄧婧;任晉生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 先聲生物醫(yī)藥科技有限公司;江蘇先聲藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/13
• 分類號(hào): C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高通量構(gòu)建單克隆抗體表達(dá)載體的方法，所述的方法包括以下步驟：

(1)分選抗原特異性單B細(xì)胞高通量反應(yīng)容器，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；

(2)以步驟(1)獲得的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，分別進(jìn)行重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR擴(kuò)增；

(3)將重鏈可變區(qū)克隆片段和輕鏈可變區(qū)克隆片段分別重組至表達(dá)載體中；所述的表達(dá)載體包含自殺基因ccdB。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的高通量反應(yīng)容器為微板形式的實(shí)驗(yàn)器具，包括但不限于12孔板，24孔板，48孔板和/或96孔板。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的方法，所述的步驟(2)的PCT擴(kuò)增優(yōu)選為巢式擴(kuò)增。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，在所述的步驟(2)后還包括純化和/或回收擴(kuò)增片段的步驟，優(yōu)選地，所述的純化和/或回收操作優(yōu)選為磁珠法。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，所述的巢式擴(kuò)增為兩輪PCR擴(kuò)增，優(yōu)選使用兩輪不同的引物，重鏈和輕鏈可變區(qū)的擴(kuò)增分別使用重鏈和輕鏈擴(kuò)增引物；每輪重鏈或輕鏈擴(kuò)增引物分別包含正向引物和反向引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，所述的表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)具有自殺基因ccdB。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，所述的表達(dá)載體分為重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體，所述的重鏈或輕鏈表達(dá)載體是在人IgG1表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上引入自殺基因ccdB；優(yōu)選所述重鏈表達(dá)載體還包含信號(hào)肽-VH-CH1-鉸鏈區(qū)-CH2-CH3的序列；所述的輕鏈表達(dá)載體中還包含信號(hào)肽-Vκ-Cκ的序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，所述的表達(dá)還包含啟動(dòng)子序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，所述的步驟(3)的操作包括：將表達(dá)載體做線性化處理得到線性化表達(dá)載體；將線性化載體、重鏈可變區(qū)克隆片段或輕鏈可變區(qū)克隆片段和重組試劑反應(yīng)液混合，連接，得到重組化的表達(dá)載體；將重組化的表達(dá)載體加入到感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，從擴(kuò)增后的細(xì)胞中提取質(zhì)粒，獲得構(gòu)建的含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體。

10.一種高通量單克隆抗體表達(dá)用于抗體發(fā)現(xiàn)的方法，所述的方法除包括權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的步驟(1)至(3)外，還包括步驟：(4)高通量瞬轉(zhuǎn)表達(dá)人鼠嵌合抗體。