[發明專利]一種多重逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測試劑緩沖液及其應用

在審

• 申請號: 201811612246.9
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN111378730A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 王進;吳夢華;石亦靜;應彩紅;楊聶
• 申請（專利權）人: 蘇州曠遠生物分子技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

本發明屬于生物醫學臨床分子檢測領域，具體涉及一種應用于熒光PCR平臺的多重逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測試劑的緩沖液及其應用。其特征在于所述緩沖液中包含PCR反應增強劑二甲基亞砜、穩定劑海藻糖。本發明優化了RT?PCR實驗的PCR緩沖液，特別是加入了一定劑量的PCR反應增強劑和穩定劑，對于一步法RT?PCR反應中的逆轉錄反應效率和DNA擴增檢測反應效率有很大程度的提高，能夠同時滿足RNA逆轉錄反應和熒光PCR反應的高效率進行。

技術領域

本發明屬于生物醫學臨床分子檢測領域，具體涉及一種應用于熒光PCR平臺的多重逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測試劑的緩沖液及其應用。

背景技術

RT-PCR（reverse transcription PCR，逆轉錄PCR，或稱為反轉錄PCR），是聚合酶鏈式反應的一種廣泛應用的變性。在RT-PCR過程中，一條RNA鏈被逆轉錄稱為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。RT-PCR的關鍵步驟是RNA的反轉錄，要求RNA模板為完整的且不含DNA、蛋白質等雜質。常用的反轉錄酶有兩種，即鳥類成隨細胞性白細胞病毒（avianmyeloblastosis virus，AMV）反轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murineleukemia virus，MMLV）反轉錄酶。

RT-PCR通常有一步法RT-PCR和兩步法RT-PCR兩種方法，一步法RT-PCR操作簡便，RT和PCR之間無需開管，能夠減少污染的可能性，RT過程得到的cDNA產物全部用于PCR擴增，使得一步法的靈敏度更高，但是單管反應是RT和PCR都不能夠在最佳反應條件下進行并且容易相互干擾；兩步法RT-PCR方法種，RT和PCR分別在最優的條件下進行使兩個反應充分發揮各自的特點，更為靈活且嚴謹，適合對付未知模板或者較為困難的模板。

PCR反應增強劑和穩定劑常見的有：二甲亞砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、甲酰胺、非離子去污劑、聚乙二醇6000、亞精胺、硫酸銨、甜菜堿(Betaine)和海藻糖（Trehalose）中的一種或多種，它們對PCR反應的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴增效率。其中，1％-10％二甲亞砜能改變引物模板配對反應的熔解溫度，從而改善GC含量高的DNA的變性情況，使聚合酶更容易在二級結構處延伸，但當濃度高時（大于10％）時會降低保真性。5％-20％甘油可提高產量，增加酶的穩定性。0.1μg/μl-1μg/μl牛血清白蛋白能提高PCR反應的效率，同時減少體系中PCR抑制物對反應的影響。1.25％-10％甲酰胺可促進某些“引物-模板”退火，降低帶有二級結構的DNA的變性溫度。硫酸銨能增加反應體系的離子強度，改變DNA的變性及退火溫度，調節酶活。0.5-2M甜菜堿有助于高GC含量和長DNA片段的PCR反應。2%-5%海藻糖可作為PCR增強劑，通過降低DNA雙鏈融解溫度，維持Taq DNA聚合酶穩定性，提高PCR反應效率，可作為酶穩定劑，維持酶的活性及熱活化后的酶活性。可中和抑制劑對DNA聚合酶的抑制作用，維持PCR擴增效率。可以根據實際需要，選擇其中的一種或多種。

發明內容

本發明提供了一種多重逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測試劑緩沖液，以一步法RT-PCR為方法基礎，針對可能的影響因素采取相應的措施，設計了一種RT-PCR緩沖液。

本發明特征在于：優化了RT-PCR實驗PCR反應緩沖液，特別是加入了一定劑量的PCR反應增強劑DMSO、穩定劑海藻糖。對于一步法RT-PCR反應中的逆轉錄反應效率和DNA擴增檢測反應效率有很大程度的提高，能夠同時滿足RNA逆轉錄反應和熒光PCR反應的高效率進行。

本發明提供一種多重逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測試劑緩沖液，包括Tris鹽、硫酸銨、氯化鎂和氯化鉀的水溶液，所述緩沖液pH值為8.0~10.0，所述緩沖液中Tris鹽、硫酸銨、氯化鎂和氯化鉀的濃度分別為50~100mM、10~50mM、1.0~5.0mM和25~100mM。更優選的，所述緩沖液pH值為9.2，所述緩沖液中Tris鹽、硫酸銨、氯化鎂和氯化鉀的濃度分別為75mM、20mM、3mM和80mM。