[發明專利]用于檢測PIK3CD基因E1021K位點突變的探針和引物組合及試劑盒

在審

• 申請號: 201811584627.0
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109337976A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 王薇;宋紅梅;伍建
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 北京智匯東方知識產權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;關艷芬

本發明提出一種用于檢測人類PIK3CD基因C.3061G>A,P.E1021K位點突變的突變型及野生型探針和引物組合。正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探針包括突變型探針，所述突變型探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本發明通過設計科學合理的特異性的PIK3CD基因C.3061G>A,P.E1021K檢測引物和探針，以更好的實現基于熒光定量PCR的方法檢測，基于本發明提供的探針和引物的基礎上所實現的熒光定量PCR的方法在保證高靈敏度和高特異性的基礎上，實驗周期更短、成本更低。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，尤其涉及一種用于檢測人類PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位點突變的探針和引物組合及試劑盒。

背景技術

PI3K-δ過度活化綜合征是由PIK3CD基因突變引起的一種常染色體顯性遺傳免疫缺陷病。該病通常表現為T細胞及B細胞分化和功能的缺陷。主要臨床癥狀有：兒童期起病的反復呼吸道感染、淋巴結腫大、結節性淋巴樣增生、脾大、進行性淋巴細胞減少、抗體應答缺陷以及CMV和/或EBV感染導致的病毒血癥。雖然淋巴結病變和結節性淋巴樣增生是非癌性的(良性的)，但PI3K-δ過度活化綜合征也增加了形成癌癥B細胞淋巴瘤的風險。該病起病早，病情重，嚴重者可致命。而該病可以通過雷帕霉素治療，效果較好。因此早期診斷將有利于患兒的盡早治療，挽救患者生命。

目前針對PI3K-δ過度活化綜合征可以通過對PIK3CD全基因Sanger測序或高通量測序技術(Next generation Sequencing)對PIK3CD基因及其它基因進行深度測序，可以獲得PIK3CD整個基因內的突變信息，但不可避免的存在測序成本高、實驗周期長等缺點。前期研究發現c.3061G>A,p.E1021K為該病的突變熱點，中華兒科雜志所報道的中國最大宗PI3K-δ過度活化綜合征患者均為該點突變。因此如何實現快速的檢測這個位點可以迅速的對該病進行初篩，縮短診斷周期、降低檢測成本，成為本領域技術人員亟待解決的技術難題。

發明內容

本發明針對上述的技術問題，提出一種用于檢測人類PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位點突變的探針和引物組合及試劑盒，以使PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位點突變的檢測靈敏度更高、特異性更高且可重復性好，同時能夠降低試驗成本，實現PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位點突變的快速檢測，并且能夠區分野生型、雜合突變型及純合突變型。如果該病存在體細胞突變或嵌合體，也可檢測其突變頻率。

一種用于檢測人類PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位點突變的探針和引物組合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探針包括突變型探針，所述突變型探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

作為優選，所述正向引物、反向引物和所述突變型探針的摩爾比為1:1:1。

作為優選，所述探針還包括野生型探針，所述野生型探針的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

作為優選，所述突變型探針和野生型探針的5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團。

作為優選，所述熒光基團為FAM、CY5、HEX、VIC、ROX中的任一種。

其中所述熒光基團和淬滅基團可基于實際的使用需要或成本考慮進行篩選。具體的所述突變型探針的熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1；所述野生型探針熒光基團為CY5，淬滅基團為BHQ2。或者所述所述突變型探針的熒光基團為CY5，淬滅基團為BHQ2；所述野生型探針熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1。