[發明專利]一種基于流式細胞術超高通量分離釀酒酵母單倍體的方法

在審

• 申請號: 201811580414.0
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109355245A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 周景文;陳堅;曾偉主;方芳;堵國成;夏小樂;張偉平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基于流式細胞術超高通量分離釀酒酵母單倍體的方法，屬于高通量篩選技術領域。本發明通過優化子囊孢子處理條件，得到了釀酒酵母孢子懸液的最佳制備條件。利用PI和FDA染料分別對孢子懸液中活性孢子和失活細胞進行染色，通過基于流式細胞儀分析染色樣品，實現了對釀酒酵母孢子的活性區分及孢子的絕對計數。本發明確立了最優的孢子懸液制備條件，建立了基于流式細胞儀的超高通量釀酒酵母單倍體分離技術。

技術領域

本發明涉及一種基于流式細胞術超高通量分離釀酒酵母單倍體的方法，屬于高通量篩選技術領域。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在發酵工業中有廣泛應用，如釀酒工業、生物能源產業等。同時作為模式生物，其擁有遺傳背景清晰、基因操作簡便、培養周期較短等優點，在基礎研究中也有廣泛應用。在發酵工業領域，雜交育種是一種傳統、高效的提高釀酒酵母生產性能的育種手段。通過將擁有不同優良性狀的單倍體進行雜交，而后分離單倍體，可以篩選得到整合不同優良性狀的子代單倍體，提高工業生產性能。在基礎研究領域，通過雜交不同表型單倍體細胞，而后分離子代單倍體、進行特定表型分組、全基因組關聯分析，可以精確定位與特定表型差異相關的基因型差異。

傳統釀酒酵母單倍體分選是利用孢子比營養細胞耐熱性高的特點，通過58℃熱處理殺死營養細胞，而后涂布YPD平板進行分離。這種方法需要大量的人工操作，且未分散的子囊孢子也能耐受58℃熱處理條件，因此傳統分離釀酒酵母單倍體的方法存在耗時耗力、分離效率低等問題。

發明內容

為了解決上述問題，本發明建立了一種超高通量分離酵母單倍體的方法，所述方法基于流式細胞術，可在短時間內高效分離大量酵母單倍體菌株。

在本發明的一種實施方式中，所述方法包括如下步驟：

(1)制備釀酒酵母孢子懸液；

(2)利用PI和FDA染料對步驟(1)的孢子懸液進行染色；

(3)使用流式細胞儀檢測孢子活性；

(4)利用流式細胞儀分選有活性的孢子，直接將單個活性孢子分選到裝有固體培養基的高通量孔板中。

在本發明的一種實施方式中，所述方法還包括驗證孢子生長后單倍體酵母配型。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)中的孢子懸液可以包括二倍體營養細胞、子囊孢子、不同活性的分生孢子。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)中的孢子懸液通過蝸牛酶處理產孢樣品。

在本發明的一種實施方式中，向產孢樣品中加入樣品質量2～3％的蝸牛酶，28～30℃振蕩孵育25～35min。

在本發明的一種實施方式中，向產孢樣品中加入樣品質量2.5％的蝸牛酶，30℃振蕩孵育30min。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)中的孢子懸液是通過蝸牛酶處理產孢樣品后，添加玻璃珠振蕩后得到的；所述玻璃珠振蕩具體是：加入占孢子懸液體積35～45％的粒徑425～600nm玻璃珠，振蕩45～90s，離心去除玻璃珠，收集細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(2)的染色是將孢子懸液與6～8μg/mL PI染料、3～5μg/mL FDA染料混合，避光孵育15～20min。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(2)的染色，具體是：將待分選孢子懸液濃度調整為10⁵～10⁶個細胞/mL，將等體積孢子懸液分別與8μg/mL PI染料、4μg/mL FDA染料混合，避光4℃孵育20min。