[發明專利]一種基于酶誘導磷酸根離子激活的近紅外熒光免疫分析試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201811565498.0
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN111351924B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 劉?;陳學元;柯建熙;盧珊;黃萍;周山勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院福建物質結構研究所
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

本發明公開了一種基于酶誘導磷酸根離子作為近紅外染料熒光激活劑的免疫分析試劑盒及檢測方法，屬于有機染料發光和生物分析技術領域。該方法通過待測物結合抗體的標記磷酸酶催化磷酸酶底物產生磷酸根離子，并與稀土離子和帶有配位基團的近紅外染料共混，利用二者的相互作用對近紅外熒光強度的影響實現待測標志物的定量分析。本發明的免疫分析方法可用于血清中低豐度疾病標志物含量的檢測。由于使用近紅外染料作為熒光信號發生體，克服了常規熒光免疫分析易受到生物組織自發熒光、光散射和檢測信號干擾等缺點，因此該檢測方法具備靈敏度高、操作簡便、熒光響應快速等優點，為臨床免疫學檢測提供了一種靈敏且性能穩定的新方法。

技術領域

本發明屬于生物分析技術領域，涉及免疫分析檢測技術，具體涉及一種基于酶誘導磷酸根離子作為近紅外染料熒光激活劑的免疫分析試劑盒及檢測方法。

背景技術

目前，癌癥、艾滋病、心腦血管疾病、糖尿病等重大疾病嚴重危害人類健康。解決這些健康問題的前提是具有可靠的疾病早期預警和診斷技術，以及精準的健康狀況評估方法。疾病標志物是反映疾病發生、發展的化學物質，針對疾病標志物的早期檢測可以輔助疾病的早期發現與診斷，能夠實現對重大疾病的及早治療或預防。基于生物體系成分復雜、疾病早期標志物濃度很低等原因，針對疾病標志物的高靈敏特異性檢測面臨著巨大的挑戰。

免疫分析是最為重要的生物分析方法之一，具備特異性強，靈敏度高，經濟簡便等特點，近年來成為世界廣泛研究的熱門課題。它主要通過借助抗原和抗體間的特異性識別反應來實現對疾病標志物的檢測。傳統的比色酶聯免疫吸附測定(ELISA)靈敏度較低，而熒光免疫分析在保留傳統免疫分析法高特異性優勢的同時，又具備靈敏度高的優勢，為檢測疾病標志物提供有效的手段。目前，基于堿性磷酸酶(ALP)的熒光免疫分析法仍主要聚焦于新型熒光底物的設計或利用熒光納米材料進行信號轉化，其合成、修飾和信號產生步驟復雜費時，并且目前該類免疫分析體系的熒光響應信號均位于見光區域(400～600nm)，會受到生物組織自發熒光和光散射等的影響，對免疫分析造成了嚴重干擾，靈敏度大大降低，檢測效果不佳，難以實現對微量抗原抗體的檢測識別。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種基于酶誘導磷酸根離子激活的近紅外熒光免疫分析試劑盒以及檢測方法。本發明的試劑盒和檢測方法可用于生物樣品中低豐度疾病標志物含量的檢測，是一種高靈敏度、特異性好且性能穩定的近紅外熒光免疫分析方法。

本發明的第一方面，提供一種基于酶誘導磷酸根離子激活的近紅外熒光免疫分析試劑盒，包括酶標板、捕獲抗體或抗原、封閉液，還包括磷酸酶標記抗體、磷酸酶底物、稀土離子溶液和近紅外染料。

根據本發明，所述試劑盒還包括清洗緩沖液和樣本稀釋液。作為示例，所述清洗緩沖液或樣本稀釋液可以獨立的選自碳酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、PBST緩沖液、Tris-HCl緩沖液。

根據本發明，所述捕獲抗原或抗體以及所述磷酸酶標記抗體可以和待測樣品中的標志物特異性結合。所述磷酸酶標記抗體可以為磷酸酶標記二抗，其中磷酸酶可以催化磷酸底物水解釋放磷酸根離子。所述磷酸酶可以為堿性磷酸酶或酸性磷酸酶。所述磷酸酶經本領域已知的交聯方法與抗體進行交聯，形成磷酸酶標記抗體，例如可經由戊二醛交聯法進行交聯。

根據本發明，所述磷酸酶底物為帶有磷脂鍵的有機化合物或其鹽，可以被磷酸酶水解而釋放磷酸根離子。具體地，所述磷酸酶底物可以為AMP、ADP、ATP、GMP、GDP、GTP、UMP、UDP、UTP、dTMP、pNPP、PPi中的一種或兩種以上。

根據本發明，所述近紅外染料可以為菁染料類、BODIPY類、羅丹明類、方酸類或卟啉類化合物中的一種或兩種以上。作為本發明的示例性技術方案，所述近紅外染料帶有配位官能團，例如羧基、羥基、氨基、磺酸基、氰基、疊氮官能團中的一種或兩種以上，可以與稀土離子發生配位而造成近紅外發光強度的變化。

根據本發明，所述稀土離子可選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥、釔和鈧中的一種或兩種以上。