[發明專利]基于轉錄組測序開發的黃杜鵑SSR引物對及篩選方法與應用

有效

• 申請號: 201811560600.8
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109504793B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 王書珍;李志良;金衛斌;張明菊;胡雨晴;杜睿琛
• 申請（專利權）人: 黃岡師范學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了基于轉錄組測序開發的黃杜鵑SSR引物對及篩選方法與應用。屬于生物技術領域。該引物是基于轉錄組測序和序列分析得到，在轉錄組測序的基礎上，對大量數據進行篩選，獲取富含SSR位點的unigene序列并進行SSR標記的引物設計，克服了目前黃杜鵑SSR分子標記數量少、開發效率低的障礙。利用黃杜鵑群體驗證SSR引物的有效性，為黃杜鵑遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜構、QTL定位、分子標記輔助育種等遺傳學研究奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及基于轉錄組測序開發的黃杜鵑SSR引物對及篩選方法與應用。

背景技術

黃杜鵑(Rhododendron molle G.Don)，又名羊躑躅、鬧羊花、悶頭花、羊不食草、八里麻、老虎花，屬于杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)黃杜鵑亞屬(Subgenuspentanthera)的落葉灌木。黃杜鵑的種子細小，發芽出苗困難，人工扦插以及分株繁殖均很難成活,因其藥用價值而導致的人為采挖，使得野生黃杜鵑現存量銳減，甚至處于瀕危狀態，屬于國家級保護植物。黃杜鵑樹枝優美、花冠碩大、色澤鮮艷，花為五裂漏斗狀，極具觀賞價值，是重要的園林綠化和觀賞植物，也是歐美國家重要的杜鵑育種資源。黃杜鵑全株器官均有藥用價值，能夠舒筋活絡、鎮痛、祛風、除濕、止咳、散淤，是治療風濕病的珍貴藥材，含有的鬧羊素是高效的藥用殺蟲劑，具有極高的藥用價值，因此具有巨大的開發潛力和應用前景。分子標記技術在品種鑒定、遺傳圖譜構建、目標基因定位、分子標記輔助育種等領域應用廣泛，是花卉研究和育種應用的重要技術手段，但是目前黃杜鵑育種中能用的分子標記數量較少，極大地限制了其在黃杜鵑遺傳多樣性研究、基因定位、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種中快速、有效的應用。

簡單重復序列(Simple sequence repeats,SSR)在真核生物基因組上廣泛分布，是由1-6個核苷酸組成的串聯重復序列具有多態信息量高、共顯性遺傳、重復性好、特異性強和技術簡單等特點，在遺傳多樣性研究、基因定位、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種研究中應用廣泛。SSR標記根據存在的位置可分為基因組SSR(gSSR)和表達序列標簽SSR(EST-SSR)。由于黃杜鵑的基因組信息尚未測序或者測序數據尚未公布，而同源物種開發的SSR標記尚無確定是否可以在黃杜鵑內跨物種使用，所以利用轉錄組數據獲取SSR分子標記更加經濟、快速、海量。此外，EST-SSR標記來源于DNA的轉錄區域，相比gSSR具有更高的通用性且此種類標記經常與功能基因連鎖，在分子標記輔助育種和重要目標性狀關聯分析上均有較高的應用價值。

第二代高通量測序技術的發展與成熟使得通過轉錄組測序高通量獲取EST-SSR標記成為了可能。目前尚未有利用黃杜鵑轉錄組數據海量開發多態性SSR標記的相關報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供基于轉錄組測序開發的黃杜鵑SSR引物對及篩選方法與應用。本發明利用RNA-seq技術對黃杜鵑花瓣材料進行轉錄組測序，將數據組裝拼接后挖掘含有SSR標記的序列，并將符合SSR引物設計要求的unigenes進行SSR標記的開發，并隨機合成部分SSR引物，進行適用性驗證。該引物的開發為黃杜鵑的遺傳多樣性和遺傳結構研究、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種、重要性狀基因定位和克隆等研究奠定基礎。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，提供一種基于轉錄組測序開發的黃杜鵑EST-SSR引物對，在檢測過程中使用30對引物，所述引物分別為：

表1.30對黃杜鵑的成套EST-SSR引物對

。

第二方面，提供上述黃杜鵑EST-SSR引物對的下述A1-A6中的任一種用途：

A1、所述EST-SSR引物對在構建黃杜鵑遺傳圖譜中的應用；

A2、所述EST-SSR引物對在黃杜鵑種質鑒定中的應用；