[發明專利]利用樹鼩骨髓間充干細胞建立HCV細胞模型的方法

有效

• 申請號: 201811555412.6
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109680000B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 陸彩霞;代解杰;孫曉梅;匡德宣;王文廣;仝品芬;李娜;李明學
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

本發明涉及一種利用樹鼩骨髓間充干細胞建立HCV細胞模型的方法，屬于生物醫藥技術領域。該方法先采用OCLN慢病毒載體對樹鼩骨髓間充干細胞進行感染，然后，加入CD81慢病毒載體繼續進行感染，接著，再加入miR?122慢病毒載體進行感染，感染4h之后，再加入體積是當前培養基體積1/2的含4μg/mL polybrene的新鮮培養基，第二天，去除舊的培養基，換上新鮮培養基繼續培養，得到HCV細胞模型，該細胞具有骨髓間充質干細胞的基本特性和分化潛能，并對HCV易感，支持HCV入胞、復制和產出具有感染性的病毒顆粒，為研究HCV的致病機制及藥物篩選提供了新的細胞模型資源。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及利用樹鼩骨髓間充干細胞建立HCV細胞模型的方法。

背景技術

丙型肝炎病毒（HCV）是一種正在嚴重危害人類健康的病毒，目前，全球HCV感染者已達1.7-2.0億人，每年感染者還在不斷遞增。HCV感染后，僅有少數（15-25%）的感染者通過自身免疫反應清除病毒，而大多數（75-85%）的感染者發展為慢性感染，其中10-20%感染者發展成肝硬化，肝硬化中約5%患者最后發展為肝癌直至死亡。目前仍然沒有疫苗可以預防，盡管已有HCV治療藥物，但其價格極其昂貴，普通患者難于支付。研究HCV的治療藥物、疫苗及發生機制需要適宜的細胞模型和動物模型。

目前HCV細胞模型主要有：淋巴細胞模型、原代肝細胞模型、肝癌細胞系模型和iPS起源的肝樣細胞模型。由于HCV在淋巴細胞模型中的復制水平低，細胞系維持時間短，加上這些細胞與肝細胞具有較大的差異，而限制了其應用。原代肝細胞主要有黑猩猩、人胚胎和樹鼩原代肝細胞。黑猩猩和人胚胎肝細胞來源有限并受倫理道德影響，重要的是原代肝細胞體外分離繁瑣耗時且不能傳代培養，培養時間有限，細胞質量和病毒血清質量不易控制，導致其應用受限。

最常用的肝癌細胞模型是基于HCV2a-JFH1-Huh7的細胞模型。盡管利用該模型可以大量復制并產生具有感染性的HCV病毒，但Huh7細胞系是一種肝細胞瘤的衍生細胞株，用其研究的實驗結果還需在原代肝細胞和體內進一步驗證。由iPS分化的肝樣細胞（HLCs）支持1a、1b和2a型HCV感染，有完整的病毒生活周期并產生先天炎癥反應（TNF-α和IL-28B分泌），且支持分離自臨床病人的1a和1b型HCV感染。但是其產生的具有感染性的病毒顆粒遠比Huh-7細胞產生的要低很多，而能分化為支持HCV感染的HLCs的iPS數量也非常少，到目前為止不超過8個細胞系。這些局限性也在一定程度上限制了其應用。所以亟需尋找一種能在體外傳代而且能使其產生大量具有感染性HCV病毒顆粒的細胞。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種利用樹鼩骨髓間充干細胞建立HCV細胞模型的方法，該方法選用樹鼩骨髓間充質干細胞作為研究細胞，利用骨髓間充質干細胞易于獲得及擴增，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能；能夠與各種病毒載體結合，進行各種基因的轉染，既能保持本身基因的穩定性，還能高效表達所轉染基因的特性，將既能促進干細胞向肝細胞分化，又能促進HCV在細胞內感染的miR-122和HCV入胞的兩個最為關鍵的受體CD81和Occludin（OCLN）導入骨髓間充質干細胞，解決了原代肝細胞不能傳代和肝癌細胞系研究HCV不足的問題。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

利用樹鼩骨髓間充干細胞建立HCV細胞模型的方法，包括如下步驟：

先采用OCLN慢病毒載體對樹鼩骨髓間充干細胞進行感染，然后，加入CD81慢病毒載體繼續進行感染，接著，再加入miR-122慢病毒載體進行感染，感染4h之后，再加入體積是當前培養基體積1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鮮培養基，第二天，去除舊的培養基，換上新鮮培養基繼續培養，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；之后，將HCVcc病毒接種于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV細胞模型；