[發明專利]用于檢測食源性致病菌的核酸試劑、試劑盒及系統

在審

• 申請號: 201811549852.0
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109576384A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 王雷;張淼;馮志迪;林笑冬;王曉艷;張志強
• 申請（專利權）人: 北京卓誠惠生生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12M1/00;C12M1/34;C12M1/26
• 代理公司: 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙) 11447
• 代理人: 蘇瑞;耿超

1.一種用于檢測食源性致病菌的核酸試劑，其中，所述核酸試劑包括分別彼此獨立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-42所示的引物和SEQ ID NO.45-65所示的探針。

2.根據權利要求1所述的核酸試劑，其中，相對于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分別由SEQ ID NO.2-42所示的引物的含量各自為0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-0.1μM、0.5-0.6μM、0.6-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-0.8μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.4-0.5μM，分別由SEQID NO.45-65所示的探針的含量各自獨立地為0.1-0.3μM。

3.根據權利要求1所述的核酸試劑，其中，所述核酸試劑還包括陽性內質控；所述的陽性內質控含有SEQ ID NO.43-44所示的引物、SEQ ID NO.66所示的探針和pET28a質粒。

4.根據權利要求1所述的核酸試劑，其中，所述核酸試劑包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-12,43-44所示的引物和SEQ ID NO.45-50,66所示的探針；B管含有SEQ IDNO.13-24,43-44所示的引物和SEQ ID NO.51-56,66所示的探針；C管含有SEQ ID NO.25-36,43-44所示的引物和SEQ ID NO.57-62,66所示的探針；D管含有SEQ ID NO.37-42,43-44所示的引物和SEQ ID NO.63-65,66所示的探針。

5.根據權利要求4所述的核酸試劑，其中，SEQ ID NO.45-47,51-53,57-59,63所示的探針具有第一熒光標記；SEQ ID NO.48-49,54-55,60-61,64-65所示的探針具有第二熒光標記；SEQ ID NO.50,56,62,66所示的探針具有第三熒光標記；所述第一熒光標記、所述第二熒光標記、所述第三熒光標記各不相同，且各自獨立地選自FAM熒光標記、JOE熒光標記、HEX熒光標記、VIC熒光標記、TAMRA熒光標和ROX熒光標記中的一種。

6.一種用于檢測食源性致病菌的試劑盒，該試劑盒含有權利要求1～5中任意一項所述的核酸試劑，并且可選地，所述試劑盒還含有反應體系緩沖液、氯化鎂、DNA聚合酶、dNTP和水中的至少一種。

7.權利要求1～5中任意一項所述的核酸試劑在制備用于檢測食源性致病菌的試劑盒中的用途。

8.根據權利要求7所述的用途，其中，所述食源性致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生性李斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、霍亂弧菌、產志賀毒素大腸桿菌、氣單胞菌屬、彎曲菌屬、弧菌屬、產氣莢膜梭菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株。

9.一種用于檢測食源性致病菌的系統，該系統包括采樣器，具有A管檢測器、B管檢測器、C管檢測器、和D管檢測器的PCR儀，計算裝置以及輸出裝置，所述采樣器為容納食源性致病菌癥狀的樣本或核酸的容器，所述檢測器為裝載有權利要求5所述的核酸試劑的核酸試劑儲藏容器，所述PCR儀包括第一熒光通道、第二熒光通道、第三熒光通道和第四熒光通道；所述第一熒光通道標記、所述第二熒光通道、所述第三熒光通道和所述第四熒光通道各不相同，且各自獨立地選自FAM熒光通道、JOE熒光通道、HEX熒光通道、VIC熒光通道、TAMRA熒光通道和ROX熒光通道中的一種，所述計算裝置包括存儲器和處理器，所述存儲器中存儲有計算機程序，所述處理器被配置為執行所述存儲器中存儲的計算機程序，以實現如下的判別：

空白對照和陰陽性對照成立，則檢測結果有效；若A管第一熒光通道有Tm值為58.6℃對應的溶解峰曲線判定為沙門氏菌陽性；A管第一熒光通道有Tm值為62.1℃對應的溶解峰曲線判定為志賀氏菌陽性；A管第一熒光通道有Tm值為65.4℃對應的溶解峰曲線判定為副溶血性弧菌陽性；A管第二熒光通道有Tm值為59.2℃對應的溶解峰曲線判定為空腸彎曲菌陽性；A管第二熒光通道有Tm值為64.5℃對應的溶解峰曲線判定為結腸彎曲菌陽性；A管第三熒光通道有Tm值為57.8℃對應的溶解峰曲線判定為金黃色葡萄球菌陽性；A管第三熒光通道有Tm值為60℃對應的溶解峰曲線判定為IAC陽性，用于質控樣本提取、檢測質量；B管第一熒光通道有Tm值為58℃對應的溶解峰曲線判定為單核細胞增生性李斯特氏菌陽性；B管第一熒光通道有Tm值為61.2℃對應的溶解峰曲線判定為小腸結腸炎耶爾森氏菌陽性；B管第一熒光通道有Tm值為64.9℃對應的溶解峰曲線判定為阪崎腸桿菌陽性；B管第二熒光通道有Tm值為57.7℃對應的溶解峰曲線判定為大腸埃希氏菌陽性；B管第二熒光通道有Tm值為63.5℃對應的溶解峰曲線判定為霍亂弧菌陽性；B管第三熒光通道有Tm值為57.4℃對應的溶解峰曲線判定為產志賀毒素的大腸桿菌陽性；B管第三熒光通道有Tm值為60℃對應的溶解峰曲線判定為IAC陽性，用于質控樣本提取、檢測質量；C管第一熒光通道有Tm值為57.3℃對應的溶解峰曲線判定為氣單胞菌屬陽性；C管第一熒光通道有Tm值為61.6℃對應的溶解峰曲線判定為彎曲菌屬陽性；C管第一熒光通道有Tm值為64.9℃對應的溶解峰曲線判定為弧菌屬陽性；C管第二熒光通道有Tm值為57.4℃對應的溶解峰曲線判定為產氣莢膜梭菌陽性；C管第二熒光通道有Tm值為62.6℃對應的溶解峰曲線判定為變形桿菌陽性；C管第三熒光通道有Tm值為63.9℃對應的溶解峰曲線判定為蠟樣芽孢桿菌陽性；C管第三熒光通道有Tm值為60℃對應的溶解峰曲線判定為IAC陽性，用于質控樣本提取、檢測質量；D管第一熒光通道有Tm值為62.6℃對應的溶解峰曲線判定為嗜水氣單胞菌陽性；D管第二熒光通道有Tm值為63.1℃對應的溶解峰曲線判定為副溶血性弧菌大流行菌株；A管第三熒光通道、B管第三熒光通道、C管第三熒光通道和D管第三熒光通道分別有Tm值為60℃對應的溶解峰曲線判定為陽性內質控陽性。