[發明專利]一種積累L-5-甲基四氫葉酸乳酸乳球菌及其構建方法

在審

• 申請號: 201811547736.5
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109536430A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 劉延峰;堵國成;盧川川;李江華;劉龍;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/74;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種積累L?5?甲基四氫葉酸乳酸乳球菌及其構建方法，屬于遺傳工程領域。本發明提供的重組乳酸乳球菌可實現L?5?甲基四氫葉酸在胞內積累，發酵10h時間，菌體胞內的L?5?甲基四氫葉酸濃度可達到65ug/g DCW，為進一步代謝工程改造乳酸乳球菌生產L?5?甲基四氫葉酸奠定了基礎。本發明提供的重組乳酸乳球菌構建方法簡單，便于使用，具有很好地應用前景。

技術領域

本發明涉及一種積累L-5-甲基四氫葉酸乳酸乳球菌及其構建方法，屬于遺傳工程領域。

背景技術

L-5-甲基四氫葉酸又名(6S)-5-甲基四氫葉酸，化學名稱為(6S)-N-[4-[[(2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氫-4-氧-5-甲基-6-喋啶基)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸。L-5-甲基四氫葉酸是葉酸衍生物，可直接被人體吸收，具有很好的生物活性和功能。普通葉酸也只有轉化成L-5-甲基四氫葉酸才能參與到甲基化過程和DNA合成，其在生命活動中起著不可或缺的重要作用。

L-5-甲基四氫葉酸可以減少細胞自發性的DNA損傷，加速DNA修復。同時它也是甲硫氨酸合酶的輔因子，催化同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉變。L-5-甲基四氫葉酸是重要的甲基供體，它是S-腺苷甲硫氨酸的前體物質，對用于多種甲基化反應，如DNA、蛋白質、磷脂的甲基化都有重要作用。

L-5-甲基四氫葉酸是人體中唯一存在的游離型葉酸，也是唯一可以透過血腦屏障的葉酸類藥物，對治療阿茲海默癥有很好的的效果，因此具有很好的保健功能。此外它還可以與其他一些抗癌藥物如甲酰蝶呤等配伍使用，可以減少藥物的副作用。同時，L-5-甲基四氫葉酸對于巨幼紅細胞貧血、風濕性關節炎都有治療作用。

美國、日本和歐盟已經批準將L-5-甲基四氫葉酸作為食品添加劑使用，這使得其需求量劇增。而目前還沒有大規模生產L-5-甲基四氫葉酸的企業，工業上主要采用化學合成生產L-5-甲基四氫葉酸，但是由于其工藝復雜，合成的多為L-5-甲基四氫葉酸以消旋體形式，即D-5-甲基四氫葉酸。但D-5-甲基四氫葉酸沒有治療或是保健作用且不被人體吸收。因此必須對產物進行拆分，但拆分困難，收率都不理想。

采用生物法生產L-5-甲基四氫葉酸就不會存在同分異構體拆分問題，且相對于化學合成對環境更加友好，這也是更加符合綠色生產理念。乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類有益菌，廣泛用于食品發酵和生產宿主。乳酸菌也被美國FDA認證為“generallyregarded as safe”(GRAS)安全級別菌株，因此運用現在基因工程技術構建重組乳酸菌生產食品級L-5-甲基四氫葉酸是一種很有潛力的方式。但是，現今葉酸類物質在乳酸菌中的合成積累水平還高，其生物合成過程復雜，代謝路徑較長。如何改造乳酸菌中L-5-甲基四氫葉酸葉酸代謝途徑，提高前體物質供給，增加L-5-甲基四氫葉酸積累和減少產物損失仍是我們值得深入研究的問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是構建一種積累L-5-甲基四氫葉酸的乳酸乳球菌，并以此菌株發酵生產L-5-甲基四氫葉酸。

本發明的第一個目的是提供一株乳酸乳球菌，過表達了5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶、絲氨酸羥甲基轉移酶中的至少一種。

在本發明的一種實施方式中，以pMG36e為表達載體。

本發明的第二個目的是提供所述乳酸乳球菌的構建方法。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是將乳酸乳球菌(lactococcus lactissub sp.cremoris NZ9000)5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶編碼基因(metF)，構建到乳酸菌表達質粒pMG36e中，得到質粒pMG36e-M，電轉化至乳酸乳球菌NZ9000，得到過表達菌株命名為NZ9000-M，通過強化合成途徑，實現L-5-甲基四氫葉酸的從無到有的積累。