[發明專利]一種檢測低豐度突變序列的核酸擴增阻斷劑及應用

在審

• 申請號: 201811518798.3
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109652410A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 徐宏;楊浩;徐高連;古宏晨
• 申請（專利權）人: 上海邁景納米科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6827
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明公開了一種檢測低豐度突變序列的核酸擴增阻斷劑的設計原則，涉及突變基因的檢測領域，所述核酸擴增阻斷劑為鎖核酸(LNA)修飾的寡核苷酸，所述核酸擴增阻斷劑配對區域位于擴增序列之間，并與野生型基因序列完全配對，與突變序列至少存在一個錯配。本發明還公開了該核酸擴增阻斷劑在檢測低豐度突變序列中的應用。本發明通過LNA修飾的核酸擴增阻斷劑與突變核酸序列/野生型核酸序列的親和力存在巨大差異，從而達到高選擇性的擴增/富集樣本中突變序列的目的，該類核酸阻斷劑具有親和性高、堿基修飾位置靈活、熱穩定性好、價格低廉等優點，本發明對缺失突變、插入突變的檢測效果更顯著。

技術領域

本發明涉及突變基因的檢測領域，尤其涉及一種低豐度突變序列的核酸擴增阻斷劑的設計原則及其應用。

背景技術

基因突變是由于DNA分子中發生堿基對的增添、缺失或者改變而引起的基因結構的改變。而基因突變與很多的疾病癥狀相關，如腫瘤患者組織和外周血內含有少量的腫瘤循環DNA、初期出現的細菌和病毒耐藥情況等，因此突變基因可以作為疾病發病、預后判斷以及用藥指導的標志物。而基于核酸擴增是突變基因檢測最為常見的一種手段。

核酸擴增是大多數核酸測定法中的基本步驟。核酸的準確檢測通常是指在過量的非靶標核酸存在下擴增特定靶標核酸的能力，所述的非靶標核酸是指具有與靶標核酸相似的序列。在一些情況下，非靶標核酸與靶標核酸相差少到一個核苷酸(或者一個核苷酸堿基對)。例如在腫瘤檢測以及個性化治療的時候，需要在過量的非變異序列中靈敏可信地檢測痕量與腫瘤相關的突變等位基因，這對于早期或確認診斷、治療決定、疾病監測和預后來說都是必不可少的。然而，如何在大量野生非靶向等位基因背景下高靈敏和高特異地對突變序列進行檢測仍然具有很大的挑戰性。

目前檢測少量基因突變的方法主要有直接測序法、傳統的熒光定量PCR法和高分辨率溶解曲線法。這些方法在突變基因檢測靈敏度和檢測通量上均存在一定的不足。

Sanger基因測序法：先針對突變位點設計相應的引物，然后通過PCR擴增獲得目的基因產物，最后對PCR產物進行測序，并對測序結果進行分析。測序法的靈敏度低，只能對含量超過20％的基因突變進行檢測。因此方法不適合在臨床上應用于大量臨床樣本的分析。

變性高效液相色譜法：該方法的原理是基于發生錯配的雜合雙鏈與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將兩者分開。由于雜合雙鏈在突變位點出現了錯配，更易于形成特殊的結構，與固相的結合能力降低，因此雜合鏈要比純合鏈更優先洗脫出來，通過洗脫峰的不同判斷有無突變的存在。但是該方法儀器昂貴，對儀器設備和操作人員的專業熟練水平有很高的要求。同時在檢測時，對樣本的純度要求比較高，還存在靈敏度不足的問題(上樣量要大于0.01ng)。

高分辨率溶解曲線(申請號CN104762408B)：基于核酸的物理性質，通過飽和染料結合于PCR擴增產物，監控產物溶解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5％左右，對于陽性結果并不能確定其具體位置，最終需要通過測序法加以確認。

探針擴增阻滯突變法(amplification refractory mutation system,ARMS)(申請號CN101608240B/CN102747157A)：利用PCR引物的3末端堿基必須與模板互補才能有效擴增的原理，設計針對突變位點的特異性PCR擴增引物，進而達到檢測突變的目的。ARMS法簡單省時，但是需要事前知道突變的類型才能檢測，并且在野生模版濃度較高時，容易產生假陽性的結果，另外，這個方法的檢測靈敏度通常也僅能到1％左右。

Taqman錯配擴增突變：在該方法中，將錯配序列引入到探針中，并且在存在突變序列的情況下才檢測擴增信號。但是這種方法，如果野生模版濃度過高的時候，容易產生假陽性的結果。同時，在獲得陰性結果的情況下，突變的鑒定需要另外的測定，因此該方法是不充分的。