[發(fā)明專利]一種環(huán)狀RNA hsa_circKIAA1199_006及其特異性擴(kuò)增引物和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811508148.0
• 申請(qǐng)日: 2018-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN109371023A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王立斌;田進(jìn)海;王嘉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京弘權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長(zhǎng)明;許偉群

1.一種環(huán)狀RNA，其特征在于，所述環(huán)狀RNA在circ-RNA數(shù)據(jù)庫circBank中的全稱為hsa_circKIAA1199_006，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.權(quán)利要求1所述環(huán)狀RNA用作篩查結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物的用途。

3.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述環(huán)狀RNA的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于，所述特異性擴(kuò)增引物包括上游引物和下游引物，其中，

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述環(huán)狀RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟1，合成第一鏈cDNA：混合原料，所述原料包括權(quán)利要求1所述環(huán)狀RNA、隨機(jī)引物、ddH₂O、dNTP混合液、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶，按照第一程序控溫反應(yīng)；

步驟2，對(duì)步驟1制得的第一鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：配制擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系包括步驟1制備的cDNA、如權(quán)利要求3所示的上游引物、如權(quán)利要求3所示的下游引物、ddH₂O、PCR擴(kuò)增mix，按照第二程序控溫反應(yīng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1中，

配置反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄體系為：1μL總RNA，1μL隨機(jī)引物，10μL ddH₂O，混勻，瞬時(shí)離心，65℃變性5min；立即置冰上2min，再按以下順序加入試劑制備逆轉(zhuǎn)錄的公共體系：

其中，所述dNTP混合液包括dATP，dGTP，dCTP和dTTP；

所述第一程序?yàn)椋涸?5℃條件下保溫5min，再在42℃條件下保溫60min，最后在70℃條件下保溫5min。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2中，

所述擴(kuò)增體系按照如下配比配制：2μl步驟1制備的cDNA，0.8μl如權(quán)利要求3所述的上游引物，0.8μl如權(quán)利要求3所述的下游引物，10μlPCR擴(kuò)增Mix，加ddH₂O至總體積20μL；

所述第二程序?yàn)樵?5℃下預(yù)變性30s，然后以在95℃下保溫5s、在60℃下保溫15s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，再在95℃下保溫5s，60℃下保溫60s，最后在72℃反應(yīng)5min。

7.權(quán)利要求3所述的特異性擴(kuò)增引物在制備用于結(jié)直腸癌篩查的試劑盒中的應(yīng)用。

8.一種用于結(jié)直腸癌篩查的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求3所述的特異性擴(kuò)增引物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、ddH₂O、DNA聚合酶和dNTP混合液中的至少一種。