[發明專利]一種耐熱酯酶基因、含有該基因的工程菌及其編碼蛋白和應用

有效

• 申請號: 201811488472.0
• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109554382B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 王寶娟;王敖;李全發;王源秀;朱國萍;王鵬;吳爽;曹正宇;張婷
• 申請（專利權）人: 山東乾肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/18;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 重慶創新專利商標代理有限公司 50125
• 代理人: 李智祥

本發明公開了一種耐熱酯酶基因、含有該基因的工程菌及其編碼蛋白和應用，該酯酶基因estA'堿基序列為SEQ ID NO.1，將基因estA'與質粒連接構建重組表達載體pET28b?estA'，表達質粒轉化大腸桿菌構建重組工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b?estA'；酯酶在大腸桿菌中獲得異源表達，采用對硝基苯酚法鑒定酯酶EstA的酶學性質，具有高度熱穩定性，本發明的目的是為該酯酶的生產及其在醫藥、食品、精細化工等領域的工業應用提供服務，尤其是在需要高溫催化時，該酶更為適宜。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及基因、編碼蛋白工程技術領域，具體涉及一種耐熱酯酶基因、含有該基因的工程菌及其編碼蛋白和應用。

背景技術

酯酶(Esterases,EC 3.1.1.X)是一類能夠催化酯鍵水解和形成的酶類，廣泛分布于動物、植物和微生物。作為重要的工業用酶，酯酶目前已被廣泛應用于醫藥化工、食品工業、精細化工、生物能源、農業和環境治理等領域。隨著酯酶應用范圍的不斷拓寬，現己成為世界工業酶制劑市場上繼蛋白酶、淀粉酶之后第三大工業用酶。但是酯酶工業生產條件較為粗放，因此為了節省生產成本，尋求高熱穩定性、高催化效率的酯酶一直是人們努力的目標。

鏈霉菌(Streptomyces)屬于放線菌目鏈霉菌科鏈霉菌屬，是一類存在于土壤中的好氧、絲狀、產孢子的革蘭氏陽性細菌。鏈霉菌具有豐富的次級代謝途徑，可以產生大量的具有重要經濟價值的次級代謝物，如抗生素、水解酶類、酶抑制劑、除草劑和抗腫瘤藥物等，是極其重要的工業生產菌。鏈霉菌基因組的大小為5.5Mb-8.6Mb，約為大腸桿菌基因組的2倍，G+C含量高達70％-74％。鏈霉菌中含有豐富的酯酶基因，這些序列信息為研究者們提供了豐富的資源，但對它們的研究目前還比較少。研究者可根據這些序列信息克隆相應的酯酶基因，并對它們進行異源表達和酶學性質研究。但由于鏈霉菌基因的高GC含量及較為復雜的蛋白質翻譯系統，使鏈霉菌的基因在異源宿主中的表達常常受限。目前只有少數種類的酯酶基因在異源表達系統如大腸桿菌(Escherichia coli)、變鉛青鏈霉菌、釀酒酵母(Saccharomvcesc erevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中獲得較好的表達。酯酶基因的非翻譯區，酯酶前肽和信號膚的存在、密碼子的差異以及不同表達系統表達重組酯酶的糖基化等都會影響酯酶基因的異源表達。特別是大腸桿菌，其作為低等的原核生物，缺乏完善的翻譯后修飾系統，酯酶在其中常無法表達或以包涵體形式存在，極少獲得活性蛋白。

變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividands)TK24全基因組(Complete Genome)核苷酸序列在GenBank數據庫，登錄號(Accession number)為CP009124，該基因組大小為8.3Mb，G+C含量高達72.2％。本發明所研究基因為染色體(NZ_CP009124)上的基因座(Locus tag)SLIV_RS27090，在染色體上的核苷酸序列起始位點(Start)為6057885，終止位點(Stop)為6058688。依據基因組序列詮釋該段核苷酸序列所編碼蛋白質產物為酯酶，蛋白質產物(Protein product)編號(Accession)為WP_003976692，在GenBank中的蛋白質登錄號為AIJ16329。該段序列全長804bp，起始密碼子(Initiation codon)為TCA，終止密碼子(Stopcodon)為CAC，GC含量為72.5％，體現了鏈霉菌基因組的高GC含量特征。

發明內容

根據以上現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提出了一種耐熱酯酶基因，含有該基因的工程菌及其編碼蛋白和應用，為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種耐熱酯酶基因，該耐熱酯酶基因具有SEQ ID NO.1的堿基序列，且能在異源宿主大腸桿菌中成功表達。

一種重組質粒，該重組質粒含有所述的耐熱酯酶基因的pET-28b(+)重組質粒。

一種耐熱酯酶基因重組工程菌，該工程菌為大腸桿菌且含有所述的重組質粒表達載體。