[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)病原體的引物組、試劑盒和檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811473695.X
• 申請(qǐng)日: 2018-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111269995A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李英鎮(zhèn);宮艷萍;申奧;李晴晴;袁劍穎;吳紅龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳華大因源醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

1. 一種用于檢測(cè)病原體的引物組，其特征在于，所述引物組包括至少60對(duì)引物對(duì)，每對(duì)所述引物對(duì)由正向引物與反向引物組成，所述引物對(duì)選自SEQ ID NO：1~154所示核苷酸；

任選地，所述引物組用于在同一反應(yīng)體系中，對(duì)所述病原體的特異序列進(jìn)行多重PCR靶向擴(kuò)增。

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組還包括如SEQ ID NO：155~156所示的內(nèi)參引物。

3.一種用于檢測(cè)病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1或2所述的引物組。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括多重PCR靶向擴(kuò)增試劑組分、末端修復(fù)試劑組分、接頭連接試劑組分、文庫(kù)PCR擴(kuò)增試劑組分、逆轉(zhuǎn)錄試劑組分中的一種或多種；

任選地，所述多重PCR靶向擴(kuò)增試劑組分包括靶向擴(kuò)增緩沖液和靶向擴(kuò)增酶，優(yōu)選地，所述靶向擴(kuò)增酶是Ex Taq聚合酶；

任選地，所述末端修復(fù)試劑組分包括末端修復(fù)緩沖液和末端修復(fù)酶，優(yōu)選地，所述末端修復(fù)酶包括T4 DNA聚合酶、T4 PNK和rTaq；

任選地，所述接頭連接試劑組分包括連接緩沖液、磷酸激酶、連接酶和接頭序列；優(yōu)選地，所述連接緩沖液中含有聚乙二醇；優(yōu)選地，所述磷酸激酶是T4 PNK；優(yōu)選地，所述連接酶是T4 DNA連接酶；優(yōu)選地，所述接頭序列如SEQ ID NO：157~158所示；

任選地，所述文庫(kù)PCR擴(kuò)增試劑組分包括PCR反應(yīng)酶-緩沖液混合液和PCR反應(yīng)引物；優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)酶-緩沖液混合液是KAPA HIFI熱啟動(dòng)預(yù)混液；所述PCR反應(yīng)引物如SEQID NO：159~160所示；

任選地，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑組分包括逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT和dNTP；優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄酶是Super Script Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶。

5. 一種用于擴(kuò)增病原體的多重PCR反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系包括如權(quán)利要求1所述的引物組、Ex Taq聚合酶、dNTP和Ex Taq聚合酶的緩沖液；任選地，所述反應(yīng)體系還包括如SEQ ID NO：155~156所示的內(nèi)參引物。

6.權(quán)利要求1或2所述的引物組、權(quán)利要求3或4所述的試劑盒、或權(quán)利要求5所述的反應(yīng)體系在檢測(cè)腦炎和/或腦膜炎病原體中的應(yīng)用；

任選地，所述病原體選自陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、單增生李斯特菌、屎腸球菌、腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、頭葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌屬、布魯氏菌屬、人單純皰疹病毒1型、人單純皰疹病毒2型、人皰疹病毒3型、人皰疹病毒4型、人皰疹病毒5型、人皰疹病毒6型、新型隱球菌、格特隱球菌、人雙埃可毒屬、腸道病毒屬至少任意二十種以上。

7.一種用于檢測(cè)病原體的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括采用權(quán)利要求1或2所述的引物組對(duì)樣本核酸提取物進(jìn)行多重PCR靶向擴(kuò)增；然后對(duì)所述多重PCR靶向擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建；

任選地，所述樣本來(lái)自于腦脊液；

任選地，所述核酸提取物為RNA，所述方法還包括，在所述多重PCR靶向擴(kuò)增之前，對(duì)所述RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

8.一種非診斷目的的檢測(cè)病原體的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)權(quán)利要求7得到的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，然后對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以獲取病原體檢測(cè)結(jié)果。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括：

（a）對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾；

（b）將過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)靶標(biāo)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，然后篩選比對(duì)結(jié)果；

（c）任選地，將未比對(duì)到所述靶標(biāo)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到宿主參考基因組；

（d）根據(jù)靶標(biāo)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)檢出靶標(biāo)的指標(biāo)；

（e）獲取靶標(biāo)檢出序列數(shù)，并判斷每種病原體是否檢出；和

（f）輸出檢測(cè)結(jié)果。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟（a）過(guò)濾去除下列序列中的至少之一：（a）與接頭序列共有連續(xù)10bp以上堿基的序列；（b）讀段長(zhǎng)度低于預(yù)定閾值的序列；所述預(yù)定閾值優(yōu)選為50~55bp；（c）序列中質(zhì)量值小于5的堿基數(shù)占序列總堿基數(shù)的比值大于50%的序列；

任選地，所述步驟（b）基于下列中的至少之一篩選比對(duì)結(jié)果：（a）保留所述測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)長(zhǎng)度占比大于90%的序列；（b）保留所述測(cè)序數(shù)據(jù)中錯(cuò)配堿基數(shù)小于5%的序列；（c）保留具有比對(duì)特異性的序列，其中所述具有比對(duì)特異性的序列為唯一比對(duì)序列或多比對(duì)結(jié)果中滿(mǎn)足次優(yōu)比對(duì)分值除以最優(yōu)比對(duì)分值小于0.8的序列，其中所述唯一比對(duì)序列是唯一比對(duì)到所述病原微生物基因組一個(gè)位置上的序列；

任選地，所述步驟（c）中序列比對(duì)長(zhǎng)度占比達(dá)到80%，判斷為宿主序列；

任選地，所述步驟（d）中所述檢出靶標(biāo)的指標(biāo)包括：標(biāo)準(zhǔn)化比對(duì)序列數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化唯一比對(duì)序列數(shù)；

任選地，所述步驟（e）中根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷每種病原體是否檢出：對(duì)每種靶標(biāo)，檢出值大于檢測(cè)閾值為檢出；對(duì)每種病原體，3個(gè)靶標(biāo)中2個(gè)以上靶標(biāo)檢出時(shí)為該病原體檢出，1-2個(gè)靶標(biāo)中1個(gè)以上靶標(biāo)檢出時(shí)為該病原體檢出；陰性對(duì)照中也檢出該病原體，則該病原體屬于假陽(yáng)性結(jié)果。