[發(fā)明專利]一種基因工程釀酒酵母及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811465766.1
• 申請日: 2018-12-03
• 公開（公告）號: CN109536397B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許建韌;劉晨光;趙心清;白鳳武
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種基因工程釀酒酵母，其中YCR049C基因被失活或YCR049C基因缺失。本發(fā)明還公開了基因工程釀酒酵母的制備方法及在乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的基因工程釀酒酵母顯著提高了釀酒酵母的乙醇脅迫耐受性，并且能夠在超高濃度乙醇發(fā)酵條件下，增強(qiáng)菌株乙醇發(fā)酵性能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種乙醇脅迫耐受性提高的基因工程釀酒酵母及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

燃料乙醇是環(huán)境友好的可再生能源之一，基于生物質(zhì)通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，可 以單獨(dú)使用或與汽油混配制成乙醇汽油作為汽車燃料。釀酒酵母是乙醇發(fā)酵生產(chǎn)菌 株，已經(jīng)得到廣泛研究和應(yīng)用。由于高濃度乙醇對酵母細(xì)胞有生理毒性，發(fā)酵終點(diǎn) 乙醇濃度低的問題突出，不僅導(dǎo)致從發(fā)酵醪中分離乙醇的能耗高，而且產(chǎn)生大量廢 糟液。

通過多組學(xué)分析或基因功能驗(yàn)證等多種手段，數(shù)百個基因被證實(shí)可能與釀酒酵母乙醇脅迫響應(yīng)有關(guān)，這些基因涉及蛋白合成、氨基酸代謝、核苷酸代謝、糖的轉(zhuǎn) 運(yùn)、細(xì)胞生長、脂類代謝、細(xì)胞周期及細(xì)胞膜(壁)合成等多個功能，具有一定的 復(fù)合性。由于酵母細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，不同層次的脅迫響應(yīng)，多基因調(diào)控等綜 合因素，特別是能否通過乙醇耐性機(jī)制調(diào)控脅迫響應(yīng)基因提高菌株乙醇耐受性，仍 沒有被系統(tǒng)揭示和證實(shí)，這些研究工作的進(jìn)展將為酵母遺傳育種和工業(yè)化應(yīng)用奠定 理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

選育乙醇耐受性好的釀酒酵母菌株，對提高發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度，節(jié)省乙醇分離 能耗，減少廢糟液排量，具有十分重要的意義。為了一定程度上解決上述問題，本 發(fā)明的目的提供一種基因工程釀酒酵母，及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個方面提供了一種基因工程釀酒酵母，其中YCR049C基因被失 活或YCR049C基因缺失。

進(jìn)一步地，YCR049C基因的序列如SEQ ID NO:1所示或YCR049C基因的氨 基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

進(jìn)一步地，改造出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c。

在一個實(shí)施方式中，該基因工程釀酒酵母為釀酒酵母M8-KO049，保藏號為 CGMCCNO.16628，于2018年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心。

本發(fā)明的第二個方面提供了一種提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法，將釀酒酵母中的YCR049C基因失活，或?qū)CR049C基因缺失；其中，YCR049C基因的核苷 酸序列如SEQ IDNO:1所示或YCR049C基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明的第三個方面提供了一種上述基因工程釀酒酵母的制備方法，通過同源重組的方法敲除YCR049C基因。

進(jìn)一步地，該制備方法包括步驟1)構(gòu)建YCR049C敲除組件；步驟2)將 YCR049C敲除組件電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母；步驟3)篩選陽性克隆及鑒定。

進(jìn)一步地，YCR049C敲除組件的構(gòu)建方法為：利用PCR方法，在KanMX4融 合性篩選標(biāo)記的5’和3’兩端分別連接模式酵母S288c的YCR049C的5’和3’兩端部 分同源序列；PCR上游引物序列如SEQ ID No:3所示，PCR下游引物序列如SEQ ID No:4所示。

本發(fā)明的第四個方面提供了一種如上所述的基因工程釀酒酵母在乙醇發(fā)酵生 產(chǎn)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，發(fā)酵生產(chǎn)為高濃度葡萄糖批次發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始葡萄糖濃 度為250g/L。