[發明專利]一種載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811456234.1
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109603775A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 孫恩杰;曾凱;劉澤文;謝浩
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: B01J20/26
• 分類號: B01J20/26;B01J20/28;B01J20/30;C07K1/22;C07K17/14;C07K17/08
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明;閉釗

本發明涉及一種載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠及其制備方法和應用，首先利用共沉淀法制得了超順磁性的納米四氧化三鐵，接著采用過硫酸鉀進行改性后在其表面修飾一層聚丙烯酰胺，再通過聚丙烯酰胺中兩個相鄰的酰胺基團與Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等金屬離子螯合，最終得到了性能優異的載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠。該磁珠具有較好的磁性、分散性和穩定性，合成方法簡單，反應易于控制，可用于組氨酸標簽蛋白的分離、純化和固定化。

技術領域

本發明涉及生物層析材料技術領域，具體涉及一種載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠及其制備方法和應用。

背景技術

自1975年Porath首次提出金屬螯合親和層析技術以來，親和層析在蛋白質純化領域有著非常廣泛的應用。目前，在大多數原核生物表達的重組蛋白質末端都帶有六聚組氨酸(也稱為組氨酸標簽，His-tag)，科研人員利用金屬螯合親和層析分離得到了高純度的重組蛋白質。

金屬螯合親和層析分離的原理為：利用蛋白質表面的氨基酸與金屬離子親和力的差異實現分離純化。具體來看，過渡態金屬離子能與氮、氧、硫等原子以配位鍵結合，當金屬離子上有剩余的空軌道即可與蛋白質表面親和力強的氨基酸(如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等)的殘基配位，從而使蛋白質結合在載體表面。與傳統的親和配體(如抗原-抗體)相比，金屬螯合親和層析更穩定、更經濟，且吸附效率更高，并且磁性金屬螯合親和載體可在磁場作用下親和分離帶組氨酸標簽的蛋白質或多肽，操作更加簡便，層析材料可重復使用，可以一步實現蛋白質的純化和固定化。

金屬螯合親和層析材料一般由四部分組成，分別為載體、連接臂、螯合配體、金屬離子。理想的載體應當具備不溶于水但高度親水性、化學惰性以及具有多孔網狀結構等性質；常用的螯合配體主要是一些小分子，如氨基三乙酸、亞氨基乙二酸和三(羧甲基)乙二胺等；在螯合配體和載體之間需要一定長度的連接臂。目前常用的金屬螯合親和層析材料主要包括柱填充材料、磁性材料和凝膠材料等。其中，磁性材料具有磁響應性使其容易分離，不僅所需設備簡單而且操作簡便，能夠高效實現目標產物的分離純化及固定化。磁性親和載體的制備方法通常有包埋法和原位合成法，包埋法是以四氧化三鐵為磁核，在其表面修飾二氧化硅、殼聚糖及其他高分子，再將Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等金屬離子螯合或固定在其表面即可。

檢索發現，現有的金屬螯合親和層析材料普遍存在以下兩個問題：一是顆粒較大普遍為微米級(如CN107899552A)，使得材料的比表面積較小，影響了吸附性能；二是制備方法復雜繁瑣、周期長、需要層層向外合成，如CN107899552A、CN107754769A、CN107754767A等。在此基礎上，本發明通過過硫酸鉀改性、聚合包覆、螯合等步驟簡單、高效的制得了性能優異的載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠。該磁珠為納米級，具有更高的比表面積且表面具有較多配位基團，能高效提取帶組氨酸標簽的蛋白。

發明內容

本發明的目的在于克服現有金屬螯合親和層析材料及其制備、應用過程中存在的上述問題，提供一種新型載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠層析材料。該金屬螯合親和層析材料具有合成步驟少、反應可控程度高、每一步及總體產率較高、分離方法簡單易行、生產及使用成本較低、分散性穩定性較好等優點，利用其可實現組氨酸標簽蛋白的一步或分步純化及固定化。

本發明的目的之一在于提供一種載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠的制備方法，包括以下步驟：

(a)采用共沉淀法制備順磁性納米四氧化三鐵(Fe₃O₄)；

(b)將納米四氧化三鐵加入到過硫酸鉀水溶液中，接著將其與丙烯酰胺混合交聯體系混合，反應完成后固液分離，洗滌得到聚丙烯酰胺磁珠；

(c)將聚丙烯酰胺磁珠與金屬離子溶液混合，洗滌分離得到載金屬離子聚丙烯酰胺磁珠。