[發明專利]一種采用上轉換發光免疫層析法測定己烯雌酚的方法

在審

• 申請號: 201811449508.4
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN111257564A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 杜霞;洪霞;張淑雅
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種采用上轉換發光免疫層析法測定己烯雌酚的方法，本研究采用溶劑熱法合成上轉換納米顆粒(UCNPs)?NaYF4：Yb，Er，進行表面功能化修飾，將其與己烯雌酚(DES)單克隆抗體偶聯，制備熒光探針，以牛血清白蛋白一己烯雌酚(BSA—DES)偶聯物和羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維膜，形成試紙條檢測線(T線)和質控線(C線)，建立了上轉換發光免疫層析試紙條快速定量檢測。DES的方法。實驗結果表明：此試紙條定量檢測DES線性范圍為25～10000 ng/mL(Y=0.43927x?0.57647，R²=0.996)，檢出限為20.84 ng/mL，單個樣品檢測時間為15 min，批內和批間變異系數均小于10％，特異性識別能力強，在37℃存放下7天檢測值RSD的平均值約為15％。加標回收實驗顯示平均回收率為90.1％?115.2％，相對標準偏差小于5％，與高效液相色譜法有較好的一致性。

技術領域

本發明屬于生物檢驗領域。具體涉及己烯雌酚的測定方法。

背景技術

己烯雌酚(Dethylstilbestrol，DES)作為一種人工合成的雌激素藥物，廣泛應用于婦科病的預防和治療，同時它還具有促進動物生長和提高飼料轉化率等作用。DES可通過食物鏈進人人體，導致激素分泌異常、甚至乳腺癌和胚胎畸形等嚴重后果，因此許多國家已明令禁止將DES用于動物養殖。我國國家標準規定的DES檢測方法為液相色譜-串聯質譜法，目前用于DES檢測的方法主要有酶聯免疫分析法、高效液相色譜法、液相色譜一質譜聯用法、電化學法、放射免疫法等。以上方法準確靈敏，但存在過程復雜、操作繁瑣以及攜帶不便等缺點。因此，建立簡單、靈敏、快速的檢測方法十分必要。

近年來，基于熒光標記的免疫層析技術得到廣泛關注，量子點(Quantum dots，QDs)為免疫層析技術的常用的熒光標記物。QDs作為免疫探針，建立了檢測玉米赤霉烯酮的免疫層析方法，且靈敏度良好。段宏等利用量子點熒光微球為探針，制備免疫層析試紙條定量檢測惡性瘧原蟲。稀土摻雜上轉換納米顆粒(UCNPs)是一種新型材料，其上轉換發光機制源于稀土離子在紅外光激發下，可以轉化為高能量可見光。NaYF₄：Yb，Er為雙摻的上轉換稀土化合物，量子產率高，熒光穩定性好。與QDs相比，UCNPs具有穩定性好、亮度高、干擾背景幾乎為零、不易光解和光漂白等優點。目前，上轉換發光免疫層析技術的研究逐漸受到關注，於然等將修飾羧基的上轉換顆粒用于免疫層析試紙，檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，但抗體標記較復雜，檢測范圍窄。本研究以修飾醛基的UCNPs為載體，將DES單抗直接標記在顆粒表面，制備出新型的熒光探針，建立了上轉換免疫層析試紙條快速定量檢測DES的新方法。方法檢測范圍寬，操作簡單，適用于大量樣品現場檢測。

發明內容

本文采用己烯雌酚上轉換發光免疫層析方法，并基于上轉換發光免疫分析儀，用于己烯雌酚的快速檢測。

本發明包括以下步驟：

（1）上轉換納米材料NaYF₄：Yb，Er的合成與表面修飾：稱取0.18 mmol YbCl₃·6H₂O，0.80 mmol YCl₃·7H20和0.02 mmol ErCl₃·6H₂O，加人10 mL C₁₈H₃₄0₂和30 mL C₁₈H₃₆。將溶液加熱至160℃并維持30 min，形成均勻溶液，同時除去O₂和水，然后冷卻至50℃。逐滴加入20 mL溶有5 mmol NaOH和8 mmol NH₄F的甲醇溶液并攪拌30 min，盡快升溫至100℃除去水和甲醇。在氮氣保護下迅速加熱至320℃并維持1 h。反應完成后，溶液自然冷卻至室溫，所得產物用環己烷和乙醇洗3次，烘干備用。