[發(fā)明專利]循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲方法及捕獲試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811447767.3
• 申請日: 2018-11-29
• 公開（公告）號: CN109856388A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 駱靖華;王燕;劉霞;方楠;王建偉;伍啟熹;劉倩;劉珂弟;唐宇
• 申請（專利權(quán)）人: 北京優(yōu)迅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/574
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 韓建偉;金田蘊(yùn)

本發(fā)明公開了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲方法及捕獲試劑盒。其中，該捕獲方法包括以下步驟：S1，利用淋巴細(xì)胞分離液對外周血中的細(xì)胞進(jìn)行分離，取得白膜層細(xì)胞；S2，利用EpCAM抗體和Vimentin抗體捕獲白膜層細(xì)胞中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過增加間質(zhì)型標(biāo)記(Vimentin，波形蛋白)抗體，與EpCAM抗體混合后進(jìn)行CTC的捕獲，不僅能夠捕獲常規(guī)的上皮型CTC，還能捕獲危險(xiǎn)性更大的發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化的CTC，能夠極大的提高捕獲效率，提高CTC的檢出率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲方法及捕獲試劑盒。

背景技術(shù)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是從腫瘤病灶脫離并播散到血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案。

由于轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，而CTC被視為轉(zhuǎn)移的種子。基于人類腫瘤細(xì)胞株和小鼠模型的研究顯示，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的腫瘤細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到非常關(guān)鍵的作用。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。通過EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。

免疫磁性分離技術(shù)(immunomagnetic separation,IMS)是近年來國內(nèi)外研究的一種新的免疫學(xué)技術(shù)，它能夠從大量外周血中篩選出帶有特異性標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，其基本原理主要是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，形成細(xì)胞-抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，該復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，將含有靶抗原的目的細(xì)胞與其他細(xì)胞分離，從而達(dá)到特異性分離細(xì)胞的目的。具體分為陽性富集方法和陰性富集方法。前者通過磁珠偶聯(lián)上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)和細(xì)胞角蛋白(cytokerins,CKs)等標(biāo)志直接富集外周血中上皮來源的稀有細(xì)胞。后者通過磁珠偶聯(lián)CD45等白細(xì)胞標(biāo)志，去除外周血白細(xì)胞而間接富集稀有上皮細(xì)胞。

目前基于免疫磁性原理富集或同時(shí)檢測CTCs的技術(shù)主要有CellSearch系統(tǒng)、免疫磁性細(xì)胞分選儀(magnetric cell sorting,MACS)、AdnaTest癌細(xì)胞檢測系統(tǒng)和萊爾系統(tǒng)等。其中CellSearch檢測系統(tǒng)已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)用于檢測乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者外周血的CTCs。該系統(tǒng)利用EpCAM抗體結(jié)合表達(dá)EpCAM的腫瘤細(xì)胞，然后用免疫磁珠來覆蓋抗EpCAM抗體，最后在磁場的作用下對CTCs進(jìn)行分離。將分離得到的細(xì)胞經(jīng)固定后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-amidinophenyl)-6-indole carbamidine dihydrochloride,DAPI)熒光染料標(biāo)記細(xì)胞核，CD45熒光抗體和CK8、CK18、CK19或CKmix熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，結(jié)果分析在四色熒光顯微鏡下進(jìn)行。將DAPI+、CD45-、CK+和EpCAM+的細(xì)胞定義為CTCs。CellSearch系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)能夠較好保存，即通過熒光顯微鏡看到熒光染色的結(jié)果，直接觀察到腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。