[發明專利]一種豬巴氏桿菌多糖蛋白偶聯疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201811420793.7
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109602902B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 張毓金;嚴悌昆;謝秉超;楊球;曾憲淇
• 申請（專利權）人: 廣東漁躍生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/385
• 分類號: A61K39/385;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐翔

1.一種豬巴氏桿菌多糖蛋白偶聯疫苗，其特征在于，包括豬巴氏桿菌莢膜多糖和蛋白類載體，所述豬巴氏桿菌莢膜多糖和蛋白類載體經納米微球連接而成，所述豬巴氏桿菌莢膜多糖、蛋白類載體和納米微球的重量比為2：0.75：1；所述納米微球的內部為磁性微粒，所述磁性微粒通過高分子材料進行包裹；所述高分子材料為阿拉伯膠和木質素，所述阿拉伯膠和木質素的重量比為0.25：1；

所述蛋白類載體為破傷風類毒素；

所述豬巴氏桿菌莢膜多糖的制備方法，包括以下步驟：

S1、將豬巴氏桿菌接種于裝有500mL BHI液體培養基的三角燒瓶中，在恒溫培養搖床中振蕩8～12h，振蕩條件為28℃、160rpm，進行擴大培養，制得培養液A；

S2、低溫離心培養液A，將離心所得沉淀用PBS緩沖液溶解并高壓蒸汽滅菌，制得滅菌液B；

S3、將滅菌液B的上清液過濾，制得懸浮液C；

S4、向懸浮液C中加入1/2體積的十六烷基三甲基溴化銨，充分攪拌后4℃靜置過夜，離心，收集沉淀物，得到復合多糖；

S5、將復合多糖溶入2mol/L氯化鈣溶液中攪拌，充分溶解后離心取上清液，向上清液中加入兩倍體積的80％乙醇，4℃靜置2天，離心收集沉淀，沉淀溶于水，進行除蛋白、透析和凍干，制得豬巴氏桿菌莢膜多糖。

2.如權利要求1所述豬巴氏桿菌多糖蛋白偶聯疫苗，其特征在于，所述納米微球的制備方法，包括以下步驟：

S1、磁性微粒的制備：稱取FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O分別溶解于去離子水中，配制成Fe²⁺濃度為0.2mol/L的溶液A和Fe³⁺濃度為0.125mol/L的溶液B，將溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去離子水在10000r/min條件下攪拌，攪拌的同時緩慢滴加3mol/L的氫氧化鈉直至溶液變得黑亮時，停止加入氫氧化鈉，繼續攪拌30min后加入油酸在10000r/min條件下高速攪拌1h，然后用無水乙醇和去離子水清洗干凈，最后加以磁場分離得到磁性微粒，保存備用；

S2、取所述步驟S1中的磁性微粒與無水乙醇按照等體積加入，超聲活化30min后，置于60℃水浴中，緩慢的滴加阿拉伯膠和木質素，兩者比例為0.25：1，在N₂保護下攪拌反應10h，制成納米微球。

3.一種如權利要求1所述豬巴氏桿菌多糖蛋白偶聯疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、多糖-納米微球偶聯體的制備：向pH為6的0.1mol/L TBS緩沖溶液中加入豬巴氏桿菌莢膜多糖與納米微球，于室溫下反應18h，反應結束后進行透析，除去未反應納米微球，制得多糖-納米微球偶聯體；

S2、多糖-納米微球偶聯體的改性：向所述步驟S1中的多糖-納米微球偶聯體中加入戊二酸，200r/min下攪拌反應7h，反應結束后用PBS緩沖液進行洗滌，制得改性多糖-納米微球偶聯體，4℃保存備用；

S3、豬巴氏桿菌多糖蛋白偶聯疫苗的制備：向pH為6的0.1mol/L TBS緩沖溶液中加入所述步驟S2中的改性多糖-納米微球偶聯體以及破傷風類毒素，共反應24h，混合均勻，制得豬巴氏桿菌多糖蛋白偶聯疫苗。