[發(fā)明專利]一種微環(huán)DNA及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811415132.5
• 申請(qǐng)日: 2018-11-26
• 公開（公告）號(hào): CN109536521A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜延龍;王春鳳;楊桂連;高興;許可
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/65;C12N15/66;A61K48/00;A61K39/17;A61P31/14
• 代理公司: 成都天匯致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

本發(fā)明提供一種微環(huán)DNA及其制備方法與應(yīng)用,該微環(huán)DNA含有編碼EGFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因。制備方法包括：在CMV?EGFP?polyA閱讀框兩側(cè)分別引入lox66及l(fā)ox71位點(diǎn)；用SacII和StuI雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物一，連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞；將pYL19完整質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并引入XmaI和PacI酶切位點(diǎn)；將PGK?cre?polyA質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并引入XmaI和PacI酶切位點(diǎn)；用XmaI和PacI雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物二和擴(kuò)增產(chǎn)物三，連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞；對(duì)pYL46完整質(zhì)粒提取重組質(zhì)粒，然后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)狀態(tài)良好的人胚腎HEK?293 T細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微環(huán)DNA及其制備方法 與應(yīng)用。

背景技術(shù)

首次出現(xiàn)于1997年的微環(huán)DNA(minicircle DNA,mcDNA)是一種基于 傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA的新型載體，只包含最基本的真核表達(dá)框架(如CMV啟動(dòng)子 -目的蛋白-polyA)而缺失原核復(fù)制子及抗性選擇標(biāo)記等多余基因，具有相對(duì) 較小的分子量，與質(zhì)粒DNA相比能更高效的轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄、 翻譯效率，mcDNA與親本質(zhì)粒(patental plasmids,PP)相比其表達(dá)效率顯著增 強(qiáng)。此外，與質(zhì)粒DNA相比，mc DNA的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，免疫后 在機(jī)體內(nèi)仍維持超過90％的超螺旋結(jié)構(gòu)，而質(zhì)粒DNA免疫后的超螺旋結(jié)構(gòu) 通常低于80％，更易于形成線性結(jié)構(gòu)，減弱了表達(dá)效率及自身穩(wěn)定性。

mcDNA的制備主要依賴于同源重組位點(diǎn)及位點(diǎn)特異性重組酶如 phiC31、Cre、ParA及BxbI等。其中，Cre重組酶是一種來源于噬菌體P1的 整合酶，屬于λ整合酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp， 編碼相對(duì)分子質(zhì)量為3.8×10⁴的蛋白質(zhì)，能介導(dǎo)同源重組位點(diǎn)loxP位點(diǎn)之間 的特異性重組。PP質(zhì)粒中包含復(fù)制必需序列(pOri)、抗生素選擇性標(biāo)記(AR)、 真核CMV啟動(dòng)子、目的基因(GOI)及LoxP位點(diǎn)。在Cre酶作用下，loxP位 點(diǎn)之間發(fā)生同源重組，形成含有CMV啟動(dòng)子及GOI基因的mcDNA,以及包 含pOri和AR的小質(zhì)粒(miniplasmids，mP)，并通過密度梯度離心等方法制 備mcDNA。

mcDNA技術(shù)自出現(xiàn)以來廣泛應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域，如抗HIV研究、抗 腫瘤、防治心臟病以及干細(xì)胞研究。mcDNA作為疫苗載體首次出現(xiàn)在2013 年，與質(zhì)粒DNA相比，表達(dá)雞卵白蛋白短肽抗原的mcDNA經(jīng)皮下注射免 疫后，抗原表達(dá)量顯著增強(qiáng)，引起的免疫反應(yīng)尤其是CD8型細(xì)胞免疫反應(yīng)顯 著增強(qiáng)，針對(duì)單核李斯特菌的攻毒保護(hù)效率明顯提高，且免疫保護(hù)時(shí)間顯著 延長。mcDNA疫苗的免疫效率可通過優(yōu)化免疫途徑進(jìn)一步增強(qiáng)，在隨后的 一項(xiàng)研究中，表達(dá)HIV病毒Gag蛋白的mcDNA經(jīng)電轉(zhuǎn)免疫后可誘發(fā)高水平 的Gag蛋白表達(dá)，且與皮下注射相比其細(xì)胞免疫水平增強(qiáng)了2到3倍，體液 免疫水平增強(qiáng)1.5-倍。國內(nèi)關(guān)于mcDNA的研究起步較晚，涉及抗HBV研究、 豬源硫辛酸合成酶表達(dá)及核磁共振可視化治療等領(lǐng)域。盡管mcDNA在基因 治療及疫苗領(lǐng)域極具優(yōu)勢，但mcDNA的純化過程相對(duì)復(fù)雜且依賴于注射免疫，限制了其在集約化養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種微環(huán)DNA及其制備方法與 應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為：

第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種微環(huán)DNA的制備方法，包括以下步驟：

(1)以pMC.CMV-MCS-EF1-GFP-SV40polyA(Cat#:MN511A-1)質(zhì)粒為基 礎(chǔ)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在CMV-EGFP-polyA閱讀框兩側(cè)分別引 入lox66及l(fā)ox71位點(diǎn)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物一，其中所述引物序列分別如SEQ ID NO:1～4所示；