[發明專利]免疫測定方法、用于鑒定免疫測定的系統和試劑盒

在審

• 申請號: 201811401329.3
• 申請日: 2016-11-22
• 公開（公告）號: CN109470866A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 楊陽;趙衛國;張向輝
• 申請（專利權）人: 博陽生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N21/76
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 劉建軍;吳大建

本發明涉及光激化學發光技術領域的一種試劑盒。所述試劑盒包括第一抗體(或抗原)包被的發光微粒、標記物標記的第二抗體(或抗原)、標記物特異結合物標記的感光微粒，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟：(1)對含待測目標抗原(或抗體)的待測樣本進行化學發光免疫反應，激發和記錄化學發光的第一次和第二次讀數，并將第二次和第一次讀數之間的差值增幅記為A，(2)根據含待測目標抗原(或抗體)的已知的一系列標準物質的第一次讀數和兩次讀數的增幅A’分別做第一標準曲線和第二標準曲線；(3)將含待測目標抗原(或抗體)的待測樣本的第一次讀數和兩次讀數的增幅A分別與第一標準曲線和第二標準曲線進行比較，來確定樣本的濃度。

本申請是申請日為2016年11月22日，申請號為201611034237.7，發明名稱為“免疫測定方法、用于鑒定免疫測定的系統和試劑盒”的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及光激化學發光技術領域，具體涉及一種免疫測定方法、一種用于鑒定免疫測定的系統和一種試劑盒。

背景技術

免疫學檢測是基于抗原抗體特異性反應的原理進行的，由于其可以利用同位素、酶、化學發光物質等對被測物進行顯示或信號的放大，因此常被用于檢測蛋白質、激素等微量生物活性物質。

化學發光免疫分析則是近年來發展較迅速的非放射性免疫檢測技術，其原理是利用化學發光物質進行信號的放大，并借助其發光強度，對免疫結合過程進行直接測定，該法已成為免疫學檢測的重要方向之一。

光激化學發光法是化學發光分析技術的常用方法之一，可用于研究生物分子間的相互作用，臨床上主要用于疾病的檢測。該技術整合了高分子微粒技術、有機合成、蛋白質化學及臨床檢測等相關領域的研究。它通過感光微粒和發光微粒在一定范圍內結合，產生離子氧能量的傳遞，發出光信號，從而對待測樣本進行檢測。其中，感光微粒內部填充有感光化合物，而發光微粒內部填充有發光化合物和鑭系元素。在紅色激光(600～700nm)的激發下，感光微粒釋放出高能態的單線態氧離子(4μS)，其傳播距離約為200nm。當感光微粒和發光微粒的距離足夠接近時，感光微粒釋放的單線態氧離子能到達發光微粒，并通過一系列的化學反應，發射出520～620nm高能級的光，而被儀器檢測到。在本反應體系中，微粒的濃度很低，碰撞幾率較小，本底信號微弱。只有在感光微粒和發光微粒通過免疫反應結合以后，才會發射出明顯的光，因此系統的靈敏度很高。在疾病診斷中，常用的檢測模式包含三到四個組分：包被抗原或抗體的發光微粒、生物素或地高辛標記的抗原或抗體、親和素或抗地高辛包被的感光微粒，中和抗原或抗體等。以上各組份通過兩步以上溫育反應與待測抗原或抗體結合，并通過化學發光量的強弱對待測樣本進行定性或定量檢測。與傳統的酶聯免疫分析方法相比，它具有均相、靈敏度高和操作簡便易于自動化等特點。因此，其應用前景十分廣闊。

對于雙抗夾心的檢測模式中，當待檢測物質濃度高到一定濃度時，會因為不能形成雙抗夾心復合物從而信號值偏低的現象，稱為高劑量-鉤狀效應(HD-HOOK效應)。也就是說，高劑量-鉤狀效應是指在雙位點夾心免疫實驗中，其劑量反應曲線的高劑量區段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子，導致產生假陰性的現象。

HD-HOOK效應在免疫檢測中經常發生，其發生率占陽性樣本30％左右。由于HD-HOOK效應的存在導致被檢測樣本不能被正確區分為是由于其濃度超出檢測試劑盒的線性范圍還是本身濃度就是該值，以至于實驗誤診，尤其是導致假陰性率上升。

具體來說，一方面，在檢測高濃度的樣本時，高劑量-鉤狀效應可能導致檢測信號偏低，樣本也因此被判讀為偏低濃度。既往的解決辦法是增加試劑的組分，對待測樣本進行稀釋或進行兩步法檢測等。

另一方面，因為高劑量-鉤狀效應，當樣本濃度的升高到一定值時，信號并不能持續升高，限制了檢測范圍。既往主要通過優化抗體或提高抗體濃度等方法來拓寬檢測范圍。

常規檢測流程有以下5個步驟：反應孔中加入待測物及試劑、第一步溫育、添加LiCA通用液、第二步溫育和讀數。