[發明專利]人工合成的內含子、哺乳動物細胞重組表達載體、哺乳動物宿主細胞、表達方法及其應用

有效

• 申請號: 201811394239.6
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109468323B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 王小引;王天云;徐丹華;牛敬媛;王芳;倪天軍;郭瀟;秦川;楊獻軍
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院;河南普諾易生物制品研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/67;C12N5/10
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發明涉及一種人工合成的內含子、哺乳動物細胞重組表達載體、哺乳動物宿主細胞、表達方法及其應用，屬于生物技術領域。本發明利用人工合成的內含子，構建哺乳動物細胞重組表達載體，可以增強轉錄產物的穩定性，進而提高外源基因的表達量，降低哺乳動物細胞重組蛋白的生產成本。

技術領域

本發明涉及一種人工合成的內含子、哺乳動物細胞重組表達載體、哺乳動物宿主細胞、表達方法及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

重組蛋白在細菌、真核微生物、昆蟲細胞等宿主中的表達雖然能獲得較高的產量，但是這些表達系統缺少類似于哺乳動物細胞的翻譯后蛋白質修飾機制的功能，例如準確的N型糖基化和O型糖基化等，這會導致表達的重組蛋白缺少生物活性或因折疊錯誤而產生包涵體。與其他系統相比，哺乳動物表達系統的優勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，正因為這些優勢的存在使得表達產物在分子結構、理化性質和生物學功能方面非常接近于天然的高等生物蛋白質分子。

外源蛋白質在哺乳動物細胞中的表達量受很多因素的影響，如表達載體的調控元件、轉錄和翻譯控制因子、轉基因拷貝數、mRNA的穩定性、外源基因在染色體上的整合位點、重組蛋白對宿主細胞的潛在毒性和宿主細胞的基因組偏好性等。真核生物基因的內含子在真核生物基因表達調控中起著重要的作用，是轉基因研究中提高外源基因表達的重要元件之一。內含子能促進轉錄的起始或延伸、增加mRNA在核內的穩定性。

申請公布號為CN 105793415A的中國發明專利申請公開了CHO細胞的合成啟動子、使用轉錄因子結合位點模塊生產合成啟動子的方法，但是目前并未見內含子元件對哺乳動物細胞轉基因表達影響的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種人工合成的內含子，該人工合成的內含子可以增強轉錄產物的穩定性，進而提高哺乳動物宿主細胞中外源蛋白的分泌表達。

本發明還提供一種哺乳動物細胞重組表達載體，該重組表達載體含上述人工合成的內含子，可以提高外源蛋白質的表達水平。

另外，本發明提供一種哺乳動物宿主細胞，該哺乳動物宿主細胞含上述哺乳動物細胞重組表達載體，可以提高哺乳動物宿主細胞中外源蛋白的分泌表達。

此外，本發明還提供一種哺乳動物細胞表達外源蛋白的表達方法，通過該方法能夠提高目的蛋白表達水平，降低生產成本。

最后，本發明提供一種人工合成的內含子、哺乳動物細胞重組表達載體、或者哺乳動物宿主細胞在提高哺乳動物細胞重組蛋白表達水平中的應用。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種人工合成的內含子，所述人工合成的內含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該人工合成的內含子可以成倍提高外源蛋白在哺乳動物細胞的表達量。

一種哺乳動物細胞重組表達載體，所述哺乳動物細胞重組表達載體含有上述人工合成的內含子的核苷酸序列。該哺乳動物細胞重組表達載體可以使EGFP基因表達量提高3～5倍，使阿達木抗體表達量提高1～2倍，進而降低了哺乳動物細胞生產重組蛋白的成本。

上述人工合成的內含子的核苷酸序列位于哺乳動物細胞重組表達載體啟動子的下游。內含子是真核基因的外顯子間隔序列，因此在構建表達載體時內含子位于啟動子下游。

上述哺乳動物細胞重組表達載體啟動子為CMV、SV40、EF-1α、CAG中的任意一種。上述啟動子是哺乳動物細胞重組表達載體常用的啟動子。

一種哺乳動物宿主細胞，所述哺乳動物宿主細胞由上述哺乳動物細胞重組表達載體轉染得到。該哺乳動物宿主細胞通過大規模培養可獲得高表達量的外源蛋白質。

上述哺乳動物宿主細胞為CHO、HEK293、BHK或SP2/O。所述哺乳動物宿主細胞為研究動物細胞表達系統的常用細胞，其培養方式簡單，易于大規模培養。