[發(fā)明專利]一種檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811383809.1
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN109655435B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江天久;陳效;陳雨;劉威;劉建軍;黃新鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市疾病預(yù)防控制中心（深圳市衛(wèi)生檢驗中心;深圳市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所）;暨南大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）OA人工抗原的制備

用活潑酯法將OA與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)，將產(chǎn)物用PBS稀釋，得到濃度為0.8～1.2mg/mL的檢測完全抗原OA-BSA，其偶聯(lián)比為10:1～12:1；

（2）樣品墊的處理

將BSA、PEG4000、PVP40000和Tween-20加至PBS中，得到樣品墊處理液，將樣品墊浸泡于樣品墊處理液中，干燥；

所述的樣品墊處理液中的各物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)分別為BSA 1～3 %、PEG4000 1～3%、PVP40000 1～3%、Tween-20 1～3 %和PBS余量，上述物質(zhì)總計為100%；

（3）結(jié)合墊的處理

用膠體金溶液標記OA單抗，得到金標抗體復(fù)合物，將金標抗體復(fù)合物噴涂于結(jié)合墊上，金標抗體的噴量為0.8～2 μL/cm，干燥；

（4）硝酸纖維素膜的處理

將步驟（1）制備的檢測完全抗原OA-BSA用PBS稀釋，得到濃度為0.1～0.6μg/mL的OA-BSA完全抗原稀釋液；制備超純水復(fù)溶沉淀FM-BSA，用PBS稀釋600倍，得到FM-BSA稀釋液；再將OA-BSA完全抗原稀釋液與FM-BSA稀釋液混合，得到熒光微球與OA-BSA的混合液，劃膜于硝酸纖維素膜的檢測線上，其中，OA-BSA的濃度為0.3mg/mL；

將所述FM-BSA稀釋液劃膜于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上；

（5）試紙的制備

在PVC底板上，依次粘貼步驟（2）制備的樣品墊、步驟（3）制備的結(jié)合墊、步驟（4）制備的硝酸纖維素膜和吸水紙，各部分在相鄰處重疊，即得到所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙；

步驟（1）、步驟（2）和步驟（4）中所述的PBS的濃度為15mmol/L ，pH=7.4。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的制備方法，其特征在于，步驟（3）中所述的OA單抗的制備方法為：用活潑酯法將OA與人的免疫球蛋白進行偶聯(lián)，得到產(chǎn)物用PBS稀釋，得到免疫抗原OA- IgG，用免疫抗原OA- IgG免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌OA單抗的細胞株，再用腹水法制備OA單抗，純化，得到純化的OA單抗；

所述的免疫抗原OA- IgG的濃度為0.8～1.2 mg/mL，偶聯(lián)比為10:1～12:1；

所述的OA單抗的濃度為2.0～3.0 mg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的制備方法，其特征在于，步驟（3）中所述的膠體金溶液的制備方法為：將100 mL雙蒸水與0.5～1.5 mL濃度為1%氯金酸溶液混合，加熱沸騰，然后加入1～3mL濃度為1%檸檬酸三鈉繼續(xù)沸騰，當溶液的顏色由黑色變?yōu)榫萍t色時停止攪拌，靜置冷卻至室溫，再按照每毫升溶液中加入8μL濃度為250mM的K₂CO₃溶液的方法調(diào)節(jié)pH值，即得所述的膠體金溶液，含膠體金的粒徑為20 nm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的制備方法，其特征在于：

步驟（3）中所述的用膠體金溶液標記純化的OA單抗的方法為將膠體金溶液與OA單抗混合，室溫下靜置；

標記量為每毫升膠體金溶液標記4μL純化的OA單抗。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的制備方法，其特征在于，步驟（4）中所述的超純水復(fù)溶沉淀FM-BSA的制備方法為：將熒光微球與超純水混合，加入EDC和NHS，避光反應(yīng)30min，再加入BSA，封閉1h，離心，即得到所述的超純水復(fù)溶沉淀FM-BSA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的制備方法，其特征在于：

步驟（1）中所述的檢測完全抗原OA-BSA的濃度為1.0 mg/mL，偶聯(lián)比為10:1；

步驟（3）中所述的將金標抗體復(fù)合物噴涂于結(jié)合墊上時，金標抗體的噴量為1.6 μL/cm；

步驟（4）中所述的OA-BSA完全抗原稀釋液的濃度為0.5 μg/mL。

7.權(quán)利要求1所述的檢測大田軟海綿酸的熒光淬滅試紙的應(yīng)用，其特征在于：將所述的熒光淬滅試紙用于檢測大田軟海綿酸。