[發明專利]一種特異性結合Taq酶的核酸適配體及其篩選方法、應用

有效

• 申請號: 201811382638.0
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN109486824B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 王進軍;張海燕;方曉娜;羅昭鋒
• 申請（專利權）人: 安徽省昂普拓邁生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C07K14/00
• 代理公司: 合肥市長遠專利代理事務所(普通合伙) 34119
• 代理人: 金宇平

本發明公開了一種特異性結合Taq酶的核酸適配體，所述核酸適配體序列至少含有A序列、B序列中的一種。本發明還公開了上述特異性結合Taq酶的核酸適配體的篩選方法，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的DNA序列的篩選方法包括如下步驟：以Taq酶為靶標物質，經磁珠篩選和SPR?SELEX篩選交替篩選得到。本發明還公開了一種核酸適配體衍生物，所述核酸適配體衍生物是由上述核酸適配體序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸適配體改造成的肽核酸。本發明還公開了上述核酸適配體或上述核酸適配體衍生物在抑制Taq酶活性中的應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種特異性結合Taq酶的核酸適配體及其篩選方法、應用。

背景技術

Taq DNA聚合酶(Thermusaquaticus DNA polymerase)，簡稱Taq酶，是從水生棲熱菌中分離出的具有熱穩定性的DNA聚合酶，此菌于1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉，其生長溫度為70-75℃，1985年，R.K.Saiki等將分離純化后的Taq DNA聚合酶應用于PCR反應，對于PCR的應用有里程碑的意義。PCR循環包括變性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右)，每一步對溫度的要求都不一樣，多數酶在高溫時即變性失活，然而該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，所以不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷，得以大量應用，同時也大大降低了成本。現該酶廣泛應用于疾病診斷與治療、傳染病檢測、藥物作用機理等醫藥領域。

Taq DNA聚合酶在75-80℃時活性最高，但是在溫度較低時，Taq酶的活性依然存在，這就會使得在PCR反應的初始階段，由于引物的量比模板的量高出很多，在儀器升溫過程中，容易出現引物互搭或引物和模板會有一些非特異性配對的現象，在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，形成引物二聚體和非特異性產物，這些非特異性產物又可作為模板在以后的PCR循環里繼續擴增，這樣非特異性產物不斷擴增積累，就會嚴重干擾目的片段的擴增從而導致目的產物擴增效率低，甚至導致特異性條帶不能擴出。

為了避免升溫過程中產生引物二聚體和非特異性產物，根據PCR體系的反應特點及關鍵成分設計了多種方案以實現PCR的熱啟動。目前，應用最多的就是通過抗體修飾來實現Taq酶的熱啟動。在低溫時，抗體與酶形成抗原-抗體復合物，Taq酶活性被封閉。當PCR反應溫度大于70℃時，抗體變性從而與Taq酶分離，Taq酶活性得以釋放，實現熱啟動PCR。但溫度降低，抗體變性無法復性，不能實現抑制Taq酶活性作用。

用核酸適配體制備的熱啟動Taq酶與常規意義上的抗體結合的熱啟動酶有所不同，當溫度升高時核酸適配體變性，與Taq酶解離，從而Taq酶可以發揮活性，當溫度降低到約45℃，核酸適配體復性后可以重新與Taq酶結合，從而抑制它的活性，因此它的熱啟動并不僅僅是反應初始的升溫階段的熱啟動，而是整個PCR的每個循環中的熱啟動。核酸適配體與抗體相比穩定性更好，制作周期短，可以通過人工合成等優勢，免去了動物免疫、飼養、蛋白提取和純化等一系列流程。

目前，在我國有關研究熱啟動DNA聚合酶的報道文章還不是很多，核酸適配體與Taq酶結合來制備熱啟動Taq酶的報道更少見。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種特異性結合Taq酶的核酸適配體及其篩選方法、應用，本發明可以與Taq酶特異性結合，抑制Taq酶的活性，且本發明篩選效率高。

本發明提出的一種特異性結合Taq酶的核酸適配體，所述核酸適配體序列至少含有A序列、B序列中的一種，其中，A序列包含以下四種序列中的至少一種：

1)、如SEQ IDNo.1所示的DNA序列；

2)、與SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性，且能夠特異性結合Taq酶的DNA序列；

3)、在嚴格條件下與SEQ ID No.1所示DNA序列雜交的DNA序列；