[發明專利]一種低滲低電導率電穿孔緩沖液及其應用

在審

• 申請號: 201811360943.X
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109593789A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 孫澤瑋;陳文靜;鄭良榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/85
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發明提供一種低滲低電導率電穿孔緩沖液，所述緩沖液每100ml含30mM NaCl。通過將Hela細胞消化，并重懸在緩沖液中，加入質粒混勻，進行電穿孔，將電擊后細胞繼續培養，行流式細胞術，即可分析EGFP陽性細胞比例。本發明所述低滲低電導率電穿孔緩沖液，因其低滲、低電導率的性質，可達到較高的電穿孔效率。本發明經比較轉染效率，證明低滲低電導率緩沖液在用量相同情況下轉染效率顯著高于DMEM，而且在價格上明顯低于市售商品。本發明所述低滲低電導率電穿孔緩沖液，配置簡便，價格低廉，轉染效率顯著高于DMEM培養基，易于推廣。

技術領域

本發明屬于實驗用緩沖液配方，涉及一種電穿孔緩沖液，尤其是涉及一種低滲低電導率電穿孔緩沖液及其應用。

背景技術

細胞轉染是一種重要的技術手段，用于研究目的基因在細胞中的功能。電穿孔是一種重要的轉染手段，可用于向細胞中轉染DNA、RNA及藥物等(Neumann,E.,1982)。目前的研究認為，電穿孔的原理為，外界電場的刺激賦予細胞膜足夠的自由能，使細胞膜磷脂分子發生重排，導致細胞膜上疏水性孔洞的產生。隨后，混合在電穿孔緩沖液中的外源DNA分子即可通過細胞膜孔洞進入到細胞內(Neumann,E.,1989)。由于商業化電穿孔緩沖液價格高昂，限制了電穿孔技術的大規模應用。因而，開發一個高效、廉價的電穿孔緩沖液十分必要。國內外部分實驗室亦有采用DMEM等培養基作為電穿孔緩沖液(Shegogue,D.,2004)，但實際操作中發現其轉染效率較低，限制了其應用。既往研究發現，轉染成功的首要步驟是外源DNA和細胞膜的有效接觸(Wolf,H.,1994；Golzio,M.,1998)。而低滲緩沖液可減少外源DNA與細胞膜之間的排斥(Nikolai Lebovka.,2008)。同時，在低滲條件下，細胞腫脹，細胞膜上磷脂分子間距大，在細胞膜孔洞形成后，孔洞不易于回封，也可增加外源DNA進入細胞的數量。因而，我們推測低滲電穿孔緩沖液可增加轉染效率。另一方面，既往研究表明，電導率對轉染效率有較大影響，降低電導率可增加電穿孔效率(Djuzenova,C.S.,1996)。因而，我們認為，采用低濃度的NaCl溶液作為電穿孔緩沖液，可達到低滲、低電導率的目的，增加電穿孔效率。

發明內容

本發明的目的是提供一種低滲低電導率電穿孔緩沖液，所述緩沖液每100ml含30mMNaCl。本發明所用緩沖液通過以下方法配制：取175.32mg NaCl溶于100ml純水中，濾器過濾除菌，即得。

本發明的另一個目的是提供上述低滲低電導率電穿孔緩沖液在Hela細胞電轉染中的應用。

本發明所述低滲低電導率緩沖液在使用時，以Hela細胞為例，將Hela細胞消化，并重懸在30mM NaCl電穿孔緩沖液中。隨后，加入2ug pEGFP-C1質粒混勻，并將混合液置入電轉杯中。使用BioRad公司電穿孔儀，采用BioRad公司預設Hela細胞電穿孔程序進行電穿孔，隨后，將電擊杯中細胞轉移到培養板中，加入DMEM培養基繼續培養。48小時后流式細胞術，分析EGFP陽性細胞比例。

本發明所述低滲低電導率電穿孔緩沖液，由于其低滲、低電導率的性質，可以達到較高的電穿孔效率。本發明經比較轉染效率的試驗證明，本申請的低滲低電導率緩沖液在用量相同情況下轉染效率顯著高于DMEM，而且在價格上明顯低于市售商品，市售商品的價格是幾千塊一瓶，折合單次100元左右，而本申請的低滲低電導率緩沖液只要幾分甚至幾毛錢即可。本發明所述低滲低電導率電穿孔緩沖液，配置簡便，價格低廉，轉染效率顯著高于DMEM培養基，易于推廣。

附圖說明

圖1為本發明的電穿孔效果示例圖。

圖2為本發明緩沖液與DMEM組及商業化電穿孔緩沖液比較的轉染效率圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。

實施例1