[發(fā)明專利]一種組織和細(xì)胞凍存液及其凍存方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811353544.0
• 申請(qǐng)日: 2018-11-14
• 公開（公告）號(hào): CN109329269A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張鍵;趙華山;薛麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 北京市誠(chéng)輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明涉及一種組織和細(xì)胞凍存液及其凍存方法，具體公開了一種神經(jīng)細(xì)胞或組織凍存液，其包含全神經(jīng)培養(yǎng)基，二甲基亞砜以及血清；所述全神經(jīng)培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基、谷氨酰胺的衍生物和細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的組合物。本發(fā)明凍存液可有效凍存原代神經(jīng)組織，保證神經(jīng)元復(fù)蘇活性。本發(fā)明適用于人或小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦神經(jīng)組織凍存，也適用于其他類似神經(jīng)細(xì)胞那樣不易凍存的細(xì)胞組織的凍存。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種組織和細(xì)胞凍存液及其凍存方法。

背景技術(shù)

在神經(jīng)生物學(xué)研究中，原代神經(jīng)元的分離培養(yǎng)，是基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化研究的重要研究工具，不過(guò)由于神經(jīng)元細(xì)胞缺乏增殖能力，一次原代分離后，有多余組織細(xì)胞不可長(zhǎng)時(shí)間保存等原因，限制了神經(jīng)組織的充分利用，因此，若能凍存未使用多余出的神經(jīng)組織，不僅可節(jié)約分離成本，也可最大的使用樣本材料。

細(xì)胞凍存是低溫保存技術(shù)，可以使細(xì)胞暫停生長(zhǎng)而被保存起來(lái)，需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇使用。從而起到細(xì)胞保種的作用。便于細(xì)胞的交換和運(yùn)送。細(xì)胞凍存液中常會(huì)加入終濃度5％-15％的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。目前對(duì)于各種細(xì)胞系的保存方法通常采用凍存方法保存，然而對(duì)于正常原代細(xì)胞(例如神經(jīng)細(xì)胞)的保存，通常存在細(xì)胞的凍存損傷，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)蘇后無(wú)法繼續(xù)存活或者培養(yǎng)效率低等問題。另一方面，對(duì)于組織樣品的凍存實(shí)施難度更大，因?yàn)樵诶鋬鲞^(guò)程中存在更大程度的組織細(xì)胞中冰晶形成的破壞作用。常用的組織凍存通常是進(jìn)行分子生物學(xué)方面的形態(tài)表達(dá)分析，而無(wú)法獲得活的原代細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于非癌化組織細(xì)胞的凍存液研究還很有限。

發(fā)明內(nèi)容

基于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種神經(jīng)細(xì)胞或組織凍存液，可凍存包括人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的原代神經(jīng)元組織。

本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種細(xì)胞或組織凍存液，其包含全神經(jīng)培養(yǎng)基，二甲基亞砜以及血清；所述全神經(jīng)培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基、谷氨酰胺的衍生物和細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的組合物。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述谷氨酰胺的衍生物為GlutaMAXTM，優(yōu)選為100倍稀釋。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑為B27。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，各組分的比例為全神經(jīng)培養(yǎng)基60％-80％，二甲基亞砜5％-15％，血清為15％-25％，優(yōu)選為全神經(jīng)培養(yǎng)基70％，二甲基亞砜10％，血清為20％。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，全神經(jīng)培養(yǎng)基各組分的比例為以體積計(jì)90-99％Neurobasal培養(yǎng)基、0.1-5％谷氨酰胺的衍生物和0.5-5％細(xì)胞培養(yǎng)添加劑優(yōu)選為97％Neurobasal培養(yǎng)基、1％谷氨酰胺的衍生物和2％細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的血清為選自胎牛血清、馬血清、羊血清、雞血清或血清替代物。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞或組織凍存液優(yōu)選為神經(jīng)細(xì)胞和組織凍存液。

本發(fā)明另一個(gè)方面提供了一種凍存細(xì)胞或組織的方法，其包括以下步驟：

1)將待凍存的組織進(jìn)行分割，分割后的組織任一邊長(zhǎng)小于5mm的小塊；或者將細(xì)胞進(jìn)行分離；

2)將步驟1)獲得的分割后的組織先浸泡于海藻酸鈉溶液，再置于氯化鈣溶液后，形成一層海藻酸鈉鈣交聯(lián)保護(hù)層即可；

3)將步驟2)獲得的保護(hù)后的組織放入權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述細(xì)胞或組織凍存液中進(jìn)行凍存。

所述Neurobasal培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基。

所述谷氨酰胺的衍生物為100倍稀釋的GlutaMAXTM(100X)。

所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27為20％B27。