[發明專利]CrpM

有效

• 申請號: 201811353438.2
• 申請日: 2018-11-14
• 公開（公告）號: CN109576287B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 劉宇鵬;李華;肖延銘;楊生玉;楊衛華
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/63;C12N15/11;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 連云港聯創專利代理事務所(特殊普通合伙) 32330
• 代理人: 劉剛

本發明公開了Crp^M基因在提高葡糖桿菌屬菌株的DHA脅迫耐受性中的應用，Crp^M基因為G.frateurii HD924環腺苷酸受體蛋白編碼基因Crp突變體，該基因第211個堿基C突變為G，相應編碼的第71個氨基酸Leu突變為Asp；第242個堿基A突變為C，相應編碼的第81個氨基酸Leu突變為Asp，Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示；通過Crp^M基因對葡糖桿菌屬菌種進行改造，可顯著提升了DHA生產菌種對產物的耐受性，能夠有效的提升甘油轉化效率、增強DHA的生產強度、簡化生產工藝、減少設備的投入、降低生產成本。

技術領域

本發明涉及生物工程和基因工程技術領域，具體涉及Crp^M基因及Crp^M操縱子在提高葡糖 桿菌屬菌株的DHA脅迫耐受性中的應用。

背景技術

1,3-二羥基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone，DHA)是最簡單的酮糖，外觀是白色粉末狀結 晶，有甜味，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等溶劑，是一種重要的精細化工產品，可作為農 藥合成中間體、精細化工原料和醫藥前體，用途廣泛且使用量大。二羥基丙酮的工業化生產 主要是利用能夠合成高活性甘油脫氫酶的微生物以甘油為底物發酵生產。目前報道最多的微 生物為葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，如Gluconobacter oxydans、Gluconobacter frateurii、 Gluconobacter melanogenus等菌種，葡糖桿菌屬生產性能穩定，甘油生成DHA的轉化率高， DHA產量可以達到150g/L以上，是工業發酵上常用的菌株。

在DHA發酵過程中，當產物DHA的積累到一定量時會抑制葡糖桿菌屬菌株的生長，造成 菌體生長停止。DHA產物的抑制作用屬于反饋抑制，據報道，基于DHA反饋抑制動力學和死 亡率動力學模型分析，當DHA濃度達到61g/L時菌體停止生長，當DHA濃度達到108g/L時甘油停止轉化。當DHA濃度過高時葡糖桿菌屬菌株細胞受到不可逆的損傷，DHA對磷酸戊糖循環也有抑制作用。產物的抑制作用限制了高生產強度發酵生產DHA，研究發現，解決底物和產物的抑制作用一般是優化發酵工藝，如通過復雜的半連續兩階段反復補料發酵、固定 化細胞、靜息細胞轉化來消除產物的抑制效果。上述工藝雖然能在一定程度上消除產物的抑 制效果，但是會增加設備投入，造成生產工藝冗長，增加發酵成本。

通過對菌種的理性設計改造，提升DHA生產菌種對產物的耐受性，是解決DHA產物抑制 效果的有效策略之一。由于DHA對葡糖桿菌屬菌株的生長抑制機制復雜，目前尚未有解析該 機制的報道。因此，通過理性改造葡糖桿菌屬菌株提高其對DHA的耐受性存在技術障礙。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術中由于DHA對葡糖桿菌屬菌株的生長抑制機制 復雜，尚缺少提升DHA生產菌種對產物的耐受性的有效策略的缺陷，通過在葡糖桿菌屬如： Gluconobacter oxydans、Gluconobacter frateurii、Gluconobactermelanogenus等菌株 中過量表達Crp突變體，能夠顯著提高葡糖桿菌屬對1,3-二羥基丙酮的耐受性，顯著增強 1,3-二羥基丙酮的產量及生產強度。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

申請人發現G.frateurii HD924環腺苷酸受體蛋白(cyclic amp receptorprotein) 編碼基因Crp的第211個堿基C突變為G，相應編碼的第71個氨基酸Leu突變為Asp；第242 個堿基A突變為C，相應編碼的第81個氨基酸Leu突變為Asp后獲得的突變體Crp^M基因能夠 顯著提高葡糖桿菌屬對1,3-二羥基丙酮的耐受性，顯著增強1,3-二羥基丙酮的產量及生產 強度。

Crp的基因如SEQ ID NO：01所示，Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示。