[發明專利]一種活細胞內原位加速的DNA馬達及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811345762.X
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109504734B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 趙永席;陳鋒;薛靜
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/25;G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 徐文權

1.一種活細胞內原位加速的DNA馬達，其特征在于，以金納米顆粒AuNP作為載體，并在其上負載三種DNA鏈；所述三種DNA鏈分別為：

第一DNA鏈，為發生運動過程的DW鏈，其3’端的巰基共價連接金納米顆粒AuNP；

第二DNA鏈，為帶有化學標記的DT鏈，其為DNA莖環結構，在該DNA莖環結構的環狀部分含有一個8-氧-7-氫脫氧鳥嘌呤oG或次黃嘌呤I損傷堿基位點，莖環結構莖部 3’端的巰基共價連接金納米顆粒AuNP，5’端修飾熒光分子TAMRA或FAM；

第三DNA鏈，為帶有化學標記的R鏈，其為DNA莖環結構，在該DNA莖環結構環狀部分含有一個脫嘌呤/脫嘧啶AP位點，其莖部 3’端的巰基共價連接金納米顆粒AuNP，5’端修飾熒光分子Cy5；

其中，第一DNA鏈即DW鏈的5’端的14個堿基與第二DNA鏈即DT鏈的環狀部分的14個堿基互補；

第一DNA鏈即DW鏈的5’端的14個堿基與第二DNA鏈即DT鏈的環狀部分互補成雙鏈DNA；DT鏈上的損傷堿基位點oG或I能被人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶hOGG1或人類烷基腺嘌呤DNA 糖基化酶hAAG作用成為脫嘌呤/脫嘧啶AP位點，再由人源脫嘌呤/脫嘧啶AP核酸內切酶APE 1酶切后，釋放出熒光；

R鏈上的脫嘌呤/脫嘧啶AP位點，直接由人源脫嘌呤/脫嘧啶AP核酸內切酶APE 1酶切后，釋放出熒光。

2.權利要求1所述的活細胞內原位加速的DNA馬達的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將待組裝的DW鏈、DT鏈和R鏈分別加入終濃度為3mM的TCEP溶液中，靜置1h；

2）將步驟1）配制的含有DW鏈的TCEP溶液加入金納米顆粒AuNP溶液中，振蕩處理1h；

3）然后向步驟2）獲得的含有DW鏈的金納米顆粒AuNP溶液中加入步驟1）制得的含有DT鏈的TCEP溶液和含有R鏈的TCEP溶液，室溫孵育過夜；

4）向步驟3）制得的溶液體系中加入NaCl緩沖液直至體系中NaCl濃度為0.3 M，室溫孵育12h；反應結束后，反應溶液經離心、洗滌處理，制得活細胞內原位加速的DNA馬達，即負載三種DNA鏈的金納米顆粒AuNP。

3.根據權利要求2所述的活細胞內原位加速的DNA馬達的制備方法，其特征在于，DW鏈、DT鏈和R鏈的摩爾比為1:9:1.5；DW鏈和金納米顆粒AuNP的摩爾比為30:1。

4.權利要求1所述的活細胞內原位加速的DNA馬達在活細胞成像監測中非疾病診斷目的的應用。

5.權利要求1所述的活細胞內原位加速的DNA馬達作為非疾病診斷目的的活細胞內源酶驅動的自校準DNA步移器的應用。

6.如權利要求4或5所述的應用，其特征在于，使用時，操作如下步驟：

1）將所述的活細胞內原位加速的DNA馬達導入活細胞內；

2）活細胞內原位加速的DNA馬達在內源酶的酶切作用下釋放熒光；

3）通過激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察，實現細胞內損傷堿基修復酶的原位成像和作用通路監測。