[發明專利]一種海洋環境來源的幾丁質酶及其基因

有效

• 申請號: 201811332636.0
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109402092B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 葉秀云;胡亞娟;李仁寬
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12R1/19;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;饒文君

本發明提供一種海洋環境來源的幾丁質酶及其基因，以及將其在大腸桿菌和酵母細胞中克隆表達的方法，所述幾丁質酶基因核苷酸序列的如SEQ ID NO.1所示；幾丁質酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；含所述基因的載體是大腸桿菌質粒或酵母質粒；含所述基因的細胞由所述載體轉化而得；所述幾丁質酶的基因的細胞是包含所述核苷酸分子或用所述載體轉化的大腸桿菌或包含所述核酸分子或用所述載體轉化的畢氏酵母。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種海洋環境來源的幾丁質酶及其基因。

技術背景

基于宏基因組學研究樣品微生物的發展使我們能夠解鎖很多功能多樣性，從而獲得新的基因和有用的生物分子。幾丁質編碼基因資源非常豐富，但是99%的微生物都是不可培養的，給獲取幾丁質基因帶來了巨大的困難。采用宏基因組法可以繞過微生物的培養環節直接研究所有微生物的基因信息。2014年，Karin Hjort等人使用土壤宏基因組構建的文庫，針對未培養的細菌群落的幾丁質酶，發現了一種新型的細菌幾丁質酶Chi18H8，Chi18H8是從宏基因組文庫中得到的第一個純化酶，并具有作為控制植物真菌病害制劑的潛力。2015年，Mariana Silvia Cretoiu等人從土壤的宏基因組文庫篩選編碼新型幾丁質分解酶的基因，成功擴增了5條完整的幾丁質酶基因，克隆并表達了一種耐鹽性幾丁質酶。2017年，Thimoteo 等人通過使用含有膠體幾丁質的平板對使用大腸桿菌構建的宏基因組庫進行基于功能的篩選，從廢水污染的土壤中鑒定出一種幾丁質酶。2015年Yuchun Liu等人利用genomic walking技術從豬糞的宏基因組獲得了一種新的外切幾丁質酶基因。

根據幾丁質酶的作用方式分類，分為幾丁質內切酶、幾丁質外切酶和N-乙酰基葡糖苷酶。幾丁質內切酶隨機切割幾丁質的β-1,4-糖苷鍵，產生幾丁二糖和可溶的的低分子量的不同聚合度的幾丁寡糖，外切幾丁質酶從還原和非還原端切割鏈以形成幾丁二糖（GlcNAc₂），N-乙酰基葡糖苷酶將GlcNAc₂水解成GlcNAc或從N-乙酰-寡糖的非還原端產生N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GLcNAc）單體。

根據氨基酸序列同源性，幾丁質酶分屬于18、19和20家族葡萄糖苷水解酶。18家族包括來自病毒、細菌、真菌、動物和某些植物幾丁質酶的幾丁質酶。19家族包含一些植物幾丁質酶和鏈霉菌幾丁質酶。家族18和19不具有氨基酸序列的相似性，它們具有完全不同的3D結構，因此據說是從不同的祖先進化而來。家族20涉及來自細菌、某些真菌和人類的N-乙酰氨基葡糖苷酶。序列同源性的分析已經將18家族幾丁質酶分成亞科A，B和C，迄今為止，亞家族B和C幾丁質酶僅在少數細菌中被鑒定出來，而亞家族A幾乎遍及陸地和水生棲息地，后者包括分子量為20-115KDa，最適溫度18-90℃，pH值2.0-10.5，等電點為3.5-8.0的蛋白質。

現有在醫學、農業和工業上有用的酶和天然產物，主要來源于容易培養的微生物。然而，在標準的實驗室條件下，絕大多數環境中的微生物是不可培養的。宏基因組文庫的表達篩選可獲得不可培養的微生物群的功能多樣性以及發現對生物技術應用有用的新型酶。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種海洋環境樣品宏基因組來源的幾丁質酶及其基因，以及將其在大腸桿菌和酵母細胞中中克隆表達的方法，提供具有潛在應用價值的新酶源。

為實現上述目的，采用以下技術方案：

本發明的幾丁質酶，所述幾丁質酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；幾丁質酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有幾丁質酶基因的載體是大腸桿菌質粒或酵母質粒；所述的載體為pET28a(+)-Chitinase或pPIC9k-Chitinase。

含有幾丁質酶的基因的細胞選大腸桿菌細胞或酵母細胞；所述細胞由所述載體轉化而得；所述細胞是包含所述核苷酸分子或用所述載體轉化的大腸桿菌或包含所述核酸分子或用所述載體轉化的畢氏酵母。