[發明專利]一種菌種保藏劑及利用該保藏劑厭氧冷凍保藏基因工程菌的方法

在審

• 申請號: 201811313009.2
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109294916A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 王洪;張斯歐
• 申請（專利權）人: 哈爾濱艾諾衛康科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 劉坤

本發明屬于菌種保藏技術領域，尤其涉及一種菌種保藏劑及利用該保藏劑厭氧冷凍保藏基因工程菌的方法。一種菌種保藏劑，所述保藏劑含有如下質量份的組分：50～80份低溫保護劑、2～5份抗生素選擇劑和5～8份分散劑。利用該保藏劑對基因工程菌進行保藏的方法是將菌種保藏劑放入厭氧管中通氮氣排氧后高溫滅菌；基因工程菌培養至對數生長期，取新鮮菌液等體積與無菌厭氧菌種保藏劑混合，此過程通氮氣排氧后置于?20℃或?80℃下冷凍保藏。厭氧冷凍保藏方法能夠達到嚴格厭氧，最大限度降低菌種的基礎代謝水平，復蘇率高，解決了基因工程菌質粒易丟失的問題，能夠保證復壯后的基因工程菌高效維持外源DNA片段相應的功能。

技術領域

本發明屬于菌種保藏技術領域，尤其涉及一種菌種保藏劑及利用該保藏劑厭氧冷凍保藏基因工程菌的方法。

背景技術

菌種保藏在微生物研究及實際應用中必不可少，由于微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在長時間內使其不發生變異而又能夠保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所述菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。

低溫冷凍保藏是菌種保藏最直接、最簡單也是最常用的方法之一，具有保存費用低、不容易發生變異、操作簡單、保存時間長等優點。其中保藏劑對于微生物的存活率有較大的影響，能夠在保藏過程中保護菌體細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性，減低細胞受到的生理損傷。

基因工程菌株中含有由載體質粒等攜帶的外源DNA片段，這些片段通常是遺傳不穩定的，在傳代過程中很容易丟失其外源質粒復制子，在菌種保藏和復壯階段也很容易因丟失外源質粒而影響基因工程菌株的相關功能。

發明內容

為解決基因工程菌在超低溫保藏和菌種復壯過程中容易丟失外源質粒復制子的問題，本發明提供了一種菌種保藏劑及利用該保藏劑厭氧冷凍保藏基因工程菌的方法。

本發明的技術方案：

一種菌種保藏劑，所述保藏劑含有如下質量份的組分：50～80份低溫保護劑、2～5份抗生素選擇劑和5～8份分散劑。

進一步的，所述保藏劑還含有0.1～0.5份的谷氨酸鈉或L-半胱氨酸。

進一步的，所述低溫保護劑為甘油、DMSO或丙三醇中的一種。

進一步的，所述抗生素選擇劑為卡那霉素、氨芐青霉素或氯霉素中的一種或幾種的組合。

進一步的，所述卡那霉素、氨芐青霉素或氯霉素均為濃度為20～25mg/L的液體，且經0.22μm濾膜過濾除菌后再加入保藏劑。

進一步的，所述分散劑由3～5份脫脂牛奶和2～3份低聚糖組成。

進一步的，所述低聚糖為海藻糖、蔗糖或麥芽糖中的一種。

一種利用本發明所述菌種保藏劑厭氧冷凍保藏基因工程菌的方法，所述方法步驟如下：

步驟一、將菌種保藏劑放入厭氧管中，向厭氧管中通一定時間氮氣后，蓋上厭氧管的塞子和蓋子，121℃高溫滅菌20min待用；

步驟二、將基因工程菌用LB培養基37℃培養過夜至對數生長期，取新鮮菌液裝入厭氧管，在通氮氣的情況下用將步驟一得到的無菌厭氧菌種保藏劑加入裝有新鮮菌液的厭氧管中，向此厭氧管中通一定時間氮氣，蓋上塞子和蓋子，置于-20℃或-80℃下冷凍保藏。

進一步的，步驟一和步驟二中向厭氧管中通氮氣的時間均為10～15min。

進一步的，所述新鮮菌液與菌種保藏劑的體積比為1:1。

本發明的有益效果：