[發(fā)明專利]一種胎盤造血干細胞制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811308030.3 | 申請日： | 2018-11-05 |
| 公開（公告）號： | CN109337871B | 公開（公告）日： | 2021-10-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 楊致亭;韓偉;邱青芳;姚立瓊;潘德芹 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東康華生物醫(yī)療科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0789 | 分類號： | C12N5/0789;A01N1/02 |
| 代理公司： | 濰坊正信致遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37255 | 代理人： | 王偉霞 |
| 地址： | 261023 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 胎盤 造血 干細胞 制備 方法 | ||
1.一種胎盤造血干細胞制備方法，其特征在于所述制備方法包括以下步驟：
（1）胎盤預(yù)處理：在無菌條件下，將新鮮采集的足月完整健康胎盤用胎盤
清洗液清洗，備用；
（2）胎盤一次灌洗：取步驟（1）中的胎盤，將胎盤灌洗液A沿胎盤臍動脈注入胎盤內(nèi)部，由臍靜脈收集灌洗后的液體組分；胎盤灌洗液A為勃脈力A，且每L勃脈力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L鏈霉素、1-4mg/mL維生素C、1-2支肝素鈉注射液；
（3）胎盤二次灌洗：取步驟（2）中的胎盤，將灌洗液B沿胎盤臍動脈注入胎盤內(nèi)部，注入過程中按壓胎盤使灌洗液浸潤胎盤內(nèi)部血管，靜置15-30min，由臍靜脈收集灌洗后的液體組分；灌洗液B為勃脈力A，且每L勃脈力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L鏈霉素、1-4mg/mL維生素C、1-2支肝素鈉注射液、0.01-0.5wt%中性蛋白酶、0.01-0.5wt%Ⅰ型膠原酶；
（4）胎盤三次灌洗：取步驟（3）中的胎盤，另取新的胎盤灌洗液A沿臍動脈注入由臍靜脈輸出，經(jīng)過2-5次反復沖洗，收集灌洗后的液體組分；
（5）混合離心：合并步驟（2）、步驟（3）和步驟（4）所收集的液體組分，
離心，去除上清，向收集的細胞沉淀中加入勃脈力A，得到細胞懸液；
（6）初步純化：取步驟（5）中的細胞懸液，將細胞懸液與淋巴細胞分離液
混合，離心，收集的白膜層即為包含了造血干細胞的單個核細胞；
（7）造血干細胞的凍存：取步驟（6）中的單個核細胞，加入勃脈力A離心洗兩遍，用4℃預(yù)冷的凍存液將得到的單個核細胞按1×106個/mL細胞量重懸，得到的細胞重懸液分裝后置于冰上，置于程序降溫凍存盒中于-80℃凍存，24h內(nèi)轉(zhuǎn)移至液氮罐中凍存；凍存液含有體積分數(shù)為10%的 DMSO和體積分數(shù)為90%、質(zhì)量濃度為30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脈力A溶液；或者凍存液為含有體積分數(shù)84%、質(zhì)量濃度為30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脈力A溶液、體積分數(shù)為10%的DMSO和體積分數(shù)為6%、質(zhì)量濃度為15-30g/L羥乙基淀粉的勃脈力A溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤造血干細胞制備方法，其特征在于：步驟（1）中的胎盤清洗液為pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液，其中每L磷酸鹽緩沖液中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L鏈霉素、1-4mg/mL維生素C、100-500mg/L慶大霉素、50-200mg/L兩性霉素B。
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