[發明專利]一種提高鹽生杜氏藻產油能力的馴化方法

有效

• 申請號: 201811305001.1
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN109355192B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 凌雪萍;段然;盧英華;周芯羽;郭曉昀;陳翠雪
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12N1/36;C12R1/89
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;姜謐

本發明公開了一種提高鹽生杜氏藻產油能力的馴化方法。本發明首先通過在開始時添加乙酰輔酶A羧化酶抑制劑，確定進行馴化的濃度范圍，之后選擇適宜的抑制劑濃度對藻種進行多次馴化和傳代，對藻種的生物量和產油能力進行測定，對藻種的遺傳穩定性進行評估，選育出了產油能力高的鹽生杜氏藻種。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種提高鹽生杜氏藻產油能力的馴化方法。

背景技術

近年來，由于全球化石燃料短缺，原油價格過度上漲以及溫室氣體增加，生物柴油的生產受到了更多關注，其中，微藻作為生產第三代生物燃料的潛在來源而得到廣泛關注。正常條件下，大部分的微藻含油量在15％到50％間；在特定的培養條件下，或是利用特殊方式篩選出的部分微藻，含油量可以高達干重的80％。

鹽生杜氏藻的脂肪酸組成與植物油相似，因此有可能成為生產生物柴油原料的替代品，在生物柴油的生產中具有很大的優勢和潛力。其中，鹽生杜氏藻的培養基鹽度高，培養過程不易染雜菌，經脅迫后油脂積累量最高可達33.4％，由微藻制備的生物柴油，其屬性如密度、酸價、過氧化值和水分含量等，均符合國標規定，且微藻生物柴油比0#柴油具有更高的碳氫比，更適合作為燃料使用。

乙酰輔酶A羧化酶是藻類脂肪酸合成過程的關鍵酶，乙酰輔酶A羧化酶抑制劑指抑制該酶活性的一類酶，其中以稀禾啶(sethoxydim，2-[1-(乙氧基亞氨基)丁基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羥基-2-環己烯-1-酮)為代表的抑制劑能夠抑制乙酰輔酶A羧化酶的活性，影響脂質合成反應的限速步驟，從而限制合成該酶能力低的藻，篩選合成脂質能力高的藻種。

已有研究表明，通過在含有一定濃度的稀禾啶的培養基里培養海藻，能夠有效抑制產油不高的海藻生長，從而篩選得到高產油海藻。在裂殖壺菌中，使用稀禾啶進行馴化，能夠提高裂殖壺菌發酵生物量、油脂產量和DHA產量。CN106754862A公開的技術方案中中提出一種高生長能力隱甲藻突變藻株的選育方法，利用誘變和稀禾啶篩選獲得了高產油脂的隱甲藻藻種。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種提高鹽生杜氏藻產油能力的馴化方法。

本發明的技術方案如下：

一種提高鹽生杜氏藻產油能力的馴化方法，使用乙酰輔酶A羧化酶抑制劑對鹽生杜氏菌進行馴化，具體包括如下步驟：

(1)將鹽生杜氏藻接種于f/2液體培養基，同時添加不同濃度的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑，同時以未添加乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的f/2液體培養基的培養過程作為對照，確定適合馴化的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的適宜濃度；

(2)將鹽生杜氏藻接種至含有上述適宜濃度的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的f/2液體培養基中，在正常條件下進行馴化培養，獲得馴化培養液；

(3)按照一定的周期對馴化培養液進行傳代，使用含有上述適宜濃度的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的f/2液體培養基作為傳代培養基；

(4)當傳代至一定次數后，將所得藻種接種至不含乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的f/2液體培養基中，培養至藻液OD₆₉₀達到1.0時，測定其中藻體生物量和油脂含量，并分析油脂組成，獲得馴化藻種；

(5)將所得馴化藻種繼續接種于不含乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的f/2液體培養基中，傳代一定次數，培養至藻液OD₆₉₀達到1.0時，測定培養液中藻體生物量和油脂含量，并分析油脂組成，以驗證所得馴化菌株的遺傳穩定性；

上述培養均為光照培養。

在本發明的一個優選實施方案中，所述乙酰輔酶A羧化酶抑制劑為稀禾啶。

進一步優選的，所述步驟(1)中，不同濃度的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的濃度為150～700μmol/L。