[發明專利]生產河豚毒素的方法

有效

• 申請號: 201811295951.0
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109337943B
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 吳冬
• 申請（專利權）人: 深圳市華唐興東生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07D491/22;C07D491/20;A61P29/00;A61P25/20;A61P9/06;A61P13/12;A61P9/12;C12R1/63
• 代理公司: 31263 上海勝康律師事務所
• 代理人: 李獻忠;邱曉敏

本發明涉及河豚毒素生產方法，包括采用本發明獨有的細胞共培養裝置，將河豚內臟組織細胞與哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)進行共培養。所述細胞共培養裝置在第一容器與第二容器的界面之間額外設有透析膜。本發明的河豚毒素生產方法可以通過細胞培養富集獲得高濃度的河豚毒素。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種生產河豚毒素的方法。

背景技術

河豚毒素(tetradotoxin，簡寫為TTX)系小分子量非蛋白質神經毒素，其中毒潛伏期短，死亡率高，毒素吸收后迅速作用于末梢神經和中樞神經系統，使神經傳導產生障礙，首先感覺神經麻痹，而后運動神經麻痹，嚴重者腦干麻痹導致呼吸循環衰竭。河豚的表皮、內臟、血液、睪丸、卵巢、肝、脾、眼球等不同組織中含有TTX，它是一種劇毒的非蛋白神經毒素。

TTX具有出色的神經止痛作用，其麻醉作用比一般麻醉藥強1000倍以上，而且具有不成癮的優點，可取代化學藥物和中草藥用于戒毒。同時，它還具有鎮靜、抗心律失常、預防腎功能衰竭及降血壓等作用。因此，其具有很大的藥用開發價值。由于河豚毒素具有極強的醫療效果，但是提取工藝復雜、不易提取，且產量非常低，因此國際市場上TTX價格昂貴，高純度的TTX每克價格高達18-20萬美金。

關于河豚毒素的起源一直是有爭議的話題，主要有“內源性起源說”和“外源性起源說”。隨著研究發現，河豚毒素的“外源性起源學說”不斷被證實，其假說是假定所有能產生TTX的生物都與其體內能分泌TTX的微生物有著密切聯系，并且已被隨后從各種攜帶TTX的生物體內提取出來的能產生TTX的細菌所證實。另外，TTX的累積機制不僅可通過食物鏈獲得，也能由其自身腸道內的細菌產生，因為海洋中有些生物也攝食與河豚同樣的食物，但它們的體內并不含有TTX，從而估計河豚體內有一種能夠儲藏TTX的機制。大多數研究者都認為，河豚體內的TTX是受食物鏈和微生物雙重影響的結果。

目前TTX的生產方法主要有化學合成法、生物組織提取法、微生物發酵法。其中化學合成法步驟繁瑣、產率低、純度不高，而組織提取法需要消耗大量的河豚魚資源，破壞生態系統。盡管微生物發酵產河豚毒素取得一定的進展，但是由于單菌株純培養發酵存在產毒菌株遺傳特性不穩定，產量低等缺陷，很難實現大規模工業化生產。因此，現有技術中迫切需要對傳統的河豚毒素生產方法進行創新和改進。

發明內容

河豚毒素主要發現存在于河豚中，另外河豚毒素也可通過食物鏈獲得。不過海洋中有些生物也與河豚攝食同樣的食物，但它們的體內并不含有TTX。因此，本發明人猜測，可能河豚體內存在一種能夠儲藏TTX的機制；并且TTX的累積機制不僅可通過食物鏈進行，還可能由河豚自身腸道內的細菌產生。

本發明人在研究中嘗試利用細胞共培養技術，希望通過河豚內臟細胞與細菌共培養來產生河豚毒素。

細胞共培養方法可包括直接接觸共培養和間接接觸共培養。直接接觸共培養是將兩種或兩種以上細胞或微生物以直接接觸方式放在同一體系中培養，僅適用于生長狀態相近或自然狀態下近鄰的兩者，雖然操作簡單，但難以定性考察指標和區分不同的細胞/微生物。

間接接觸共培養是現有技術中的主要應用方式。其又分為條件培養基共培養法和嵌入式細胞共培養法。條件培養基共培養法使用培養過某種細胞或微生物的培養基去培養另一種細胞或微生物。嵌入式細胞共培養法則是利用帶有微孔膜的嵌入式小室區分兩系統進行培養，例如常見的transwell小室培養系統。常艷等提到了一種Millicell插入式細胞培養皿(又稱Transwell小室)，在進行細胞共培養時，將Transwell小室放入培養板中，分別在上室和下室中種入細胞A和細胞B，并且上室底部設有能夠連通上室和下室的具有通透性的薄膜，使細胞B在其培養液中的成分影響到細胞A，從而研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A生長、運動等的影響(參見常艷，魏偉，《中國臨床藥理學與治療學》,2009,14(7):827-832)。