[發(fā)明專利]一種利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物的方法

有效

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• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109517866B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊瑞;劉玉茜;王德生;周中凱
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/79
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物的方法，其特征在于：步驟如下：

所述方法以紅豆提取的鐵蛋白為原料，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化作用，使殼聚糖結(jié)合于鐵蛋白上，通過凝膠過濾方法分離有效的結(jié)合組分，即得鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物，得到的鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物具有相較于鐵蛋白更高的穩(wěn)定性；

具體步驟如下：

⑴利用紅豆為原料，將紅豆種子置于4℃蒸餾水中浸泡過夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2倍體積含有質(zhì)量濃度為1％PVP的50mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄，其pH為7.0，并用內(nèi)切式勻漿機(jī)勻漿3次，每次2-3min，200目濾網(wǎng)濾去豆渣，將收集的勻漿在于6000g、4℃下離心10-15分鐘，棄沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；

⑵向蛋白粗提液中加入終濃度為50-100mM的MgCl₂晶體，溶解后立即4500-5000g離心5-10min，棄沉淀，得上清液；上清液靜置20-30min后，加入終濃度為70-100mM的檸檬酸三鈉晶體，靜置6-24h，經(jīng)10000-12000g離心20-30min后，得沉淀和離心后上清液，沉淀即為紅豆鐵蛋白，該鐵蛋白不復(fù)溶于該離心后上清液；

⑶在離心獲得的沉淀中加入其1.5-3倍體積的離心后上清液，沖洗沉淀中的淀粉和核糖體，然后10000g離心5-10min，棄上清，重復(fù)1至兩次以上，直至只有褐色沉淀；

⑷將褐色沉淀溶于1.5倍體積蒸餾水中，10000g離心5-10min，棄上清；重復(fù)兩次用5倍體積蒸餾水溶解沉淀，13000g離心5-10min，收集并合并上清液，獲得紅豆鐵蛋白，該紅豆鐵蛋白的濃度為1.0-2.0μM，其pH值為6.5-7.0；

⑸向紅豆鐵蛋白中加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及殼聚糖，酶解參數(shù)為：酶濃度5000-6000U、殼聚糖及鐵蛋白的終濃度分別為10.0μM及2.0μM、反應(yīng)時間2-3h、反應(yīng)pH 6.5-7.0、反應(yīng)溫度40-45℃，得到粗制的鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物；

⑹上述混合物經(jīng)90-100℃處理3-5分鐘，立即冷卻至25℃，獲得產(chǎn)物經(jīng)過截留分子量為100-200kDa的透析袋透析，去除未結(jié)合的殼聚糖及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，并經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾；

⑺上述濾液經(jīng)過凝膠過濾層析柱分離，其平衡液為50mM MOPS buffer，pH 6.75，100mMNaCl，通過凝膠過濾層析獲得目標(biāo)產(chǎn)物，即得鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物的方法，其特征在于：所述紅豆去雜之后置于4℃蒸餾水中浸泡過夜。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復(fù)合物的方法，其特征在于：所述步驟⑺中凝膠過濾層析柱為Sephacryl-300gel凝膠過濾層析柱。