[發明專利]一種蛋白質類膿毒癥標志物及其在嚴重膿毒癥早期預警的應用及其篩選方法

在審

• 申請號: 201811267919.1
• 申請日: 2018-10-29
• 公開（公告）號: CN109374904A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 李萌;嚴靜
• 申請（專利權）人: 浙江醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 姚宇吉

1.一種蛋白質類膿毒癥標志物，其特征在于，包括：載脂蛋白CIII，β2微球蛋白。

2.一種蛋白質類膿毒癥標志物在嚴重膿毒癥早期預警的應用，其特征在于，

通過標志物的水平獲得評價嚴重膿毒癥的預警價值，若載脂蛋白CIII水平顯著降低(P＝0.012)；β2微球蛋白水平顯著升高(P＝0.000)；則具有嚴重膿毒癥的預警作用；

標志物，包括：載脂蛋白CIII，β2微球蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種蛋白質類膿毒癥標志物在嚴重膿毒癥早期預警的應用，其特征在于，評價嚴重膿毒癥的預警價值的數值具體通過如下過程得到：

采集外周血，待血塊凝固收縮后，離心，收集血清，分別檢測載脂蛋白CIII、β2微球蛋白；

載脂蛋白CIII水平通過ELISA方法檢測；

稀釋后血清樣本加入已包被的ELISA酶標板，孵育；

用清洗緩沖液洗板，拍干酶標板，分別加入稀釋的生物素標記抗體，孵育；

用清洗緩沖液洗滌，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記親和素，孵育后用清洗緩沖液洗滌；

各反應孔中加入新配制的TMB底物溶液，避光孵育；

各反應孔中加入終止液終止反應，在ELISA檢測儀上檢測各孔OD值，計算各樣本載脂蛋白CIII蛋白的濃度；

血清樣本在全自動免疫分析儀上通過免疫比濁法檢測β2微球蛋白水平；

將兩種蛋白水平帶入Logistic逐步模型的回歸方程，經計算后評價嚴重膿毒癥的預警價值。

4.根據權利要求3所述的一種蛋白質類膿毒癥標志物在嚴重膿毒癥早期預警的應用，其特征在于，檢測各樣本蛋白濃度水平，帶入Logistic逐步模型的回歸方程，將載脂蛋白CIII和β2微球蛋白經計算后進入方程，用于評價是否為嚴重膿毒癥；

所述Logistic逐步模型的回歸方程為：

Logit(p)＝—0.08943—0.009521×(載脂蛋白CIII的蛋白濃度)+0.09736×(β2微球蛋白的濃度)

獲得Logit(p)值，通過p＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])換算得到p值，若p值大于等于0.5，即判定為嚴重膿毒癥。

5.一種蛋白質類膿毒癥標志物的篩選方法，其特征在于，包括如下過程：

一，篩選及驗證血清蛋白的患者病例入組，

差異蛋白篩選階段包括四組混合血清樣本：非嚴重膿毒癥組、嚴重膿毒癥組，嚴重膿毒癥患者確診前樣本、嚴重膿毒癥患者確診后樣本；

二，差異蛋白驗證階段：非膿毒癥組，膿毒癥組，嚴重膿毒癥組；

應用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術篩選血清中差異蛋白質；

將保存的血清樣本經高速離心、去除雜質、去除高豐度蛋白預處理后，經酶解的蛋白質片段用于iTRAQ標記，通過2DLC-MS/MS分析篩選出差異峰，得出各組蛋白表達水平；

比較四組混合血清樣本，共搜索到293個蛋白質；根據iTRAQ報告離子強度比值計算蛋白表達的倍數變化，篩選出37個差異蛋白，其中19個蛋白上調(≥1.20倍)，18個蛋白下調(≤0.83倍)；

三，對iTRAQ-2DLC-MS/MS技術篩選的顯著差異蛋白進行驗證；

經鑒定3種蛋白在非嚴重膿毒癥組與嚴重膿毒癥組間具有顯著性差異，分別是：與非嚴重膿毒癥組相比，嚴重膿毒癥組載脂蛋白CIII水平顯著降低(P＝0.012)，β2微球蛋白(P＝0.000)、血管細胞黏附分子1(P＝0.006)顯著升高；

經鑒定8種蛋白在非嚴重膿毒癥組與嚴重膿毒癥組間未見顯著性差異，分別是：谷胱甘肽過氧化物酶3(P＝0.701)、α1抗胰蛋白酶(P＝0.837)、APOE(P＝0.451)、IgA(P＝0.211)、IgG(P＝0.565)、IgM(P＝0.117)、KAP(P＝0.464)、LAM(P＝0.876)。

6.根據權利要求5所述的一種蛋白質類膿毒癥標志物的篩選方法，其特征在于，應用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術篩選血清中差異蛋白質時，每組混合樣本分別進行兩種標記檢測作為技術重復，結果取平均值。