[發(fā)明專利]用于鑒別三種孢子絲菌的熒光PCR引物、探針及檢測試劑盒

有效

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• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109207623B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設計）人: 李福秋;張明瑞;呂莎;姚春麗;夏建新;牟妍;劉士瑞;周盈
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發(fā)明提供了用于鑒別三種孢子絲菌的熒光PCR引物、探針及檢測試劑盒。通過對球形孢子絲菌、申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌的基因組進行比對，篩選得到用于鑒別三種孢子絲菌的靶序列以及針對該靶序列的多重熒光PCR引物和探針，其序列如SEQ ID NO.1?2、SEQ ID NO.3?5所示。相對于傳統(tǒng)三重熒光PCR檢測體系，本發(fā)明節(jié)省了4條擴增引物，有效降低體系中引物探針交叉干擾，提升擴增效率，節(jié)約檢測成本。本發(fā)明檢測試劑盒檢測球形孢子絲菌和申克孢子絲菌靈敏度可低至10copies，對常見其他真菌和表皮常見細菌均無非特異擴增，具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優(yōu)點，具有良好的標本檢測能力。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及用于鑒別球形孢子絲菌、申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌的多重熒光定量PCR引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物和探針進行球形孢子絲菌、申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌檢測的方法和試劑盒。

背景技術

孢子絲菌病(Sporotrichosis)是由雙相真菌申克孢子絲菌復合體(Sporothrixschenckii complex)侵犯皮膚及皮下組織引起的慢性感染性疾病。病程長，皮損可固定于局部，或延淋巴管走行，嚴重者可通過血行系統(tǒng)播散，引起內臟器官的感染，也有報道稱吸入的孢子可直接引起肺部感染。早期人們對申克孢子絲菌認識有限，認為其為單一物種。隨著基因組學以及分子檢測手段的不斷發(fā)展，發(fā)現申克孢子絲菌是由多個親緣種構成的復合體，其中球形孢子絲菌(Sporothrix globosa)、申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii)和巴西孢子絲菌(Sporothrix bransiliensis)是臨床感染中最常見的致病菌，其余孢子絲菌多為環(huán)境菌株，對人基本不致病。球形孢子絲菌在我國主要分布在東北地區(qū)，尤其是吉林省，是孢子絲菌病的高發(fā)地區(qū)。申克孢子絲菌遍布全球，巴西孢子絲菌主要分布于巴西，國內少見報道。研究表明，孢子絲菌不同親緣種之間在致病力及藥物敏感性方面存在明顯差異，因此在孢子絲菌病的診斷及治療過程中，對病原菌鑒定到種是十分必要的。

由于局部皮損真菌含量少，直接鏡檢陽性率較低，早期孢子絲菌的診斷主要依賴于組織病理及真菌培養(yǎng)。病理組織切片特殊染色，如過碘酸雪夫染色，六胺銀染色可檢測到真菌孢子。組織真菌培養(yǎng)是檢測的金標準，但耗時較長，至少需要1周時間，因此無法作為臨床快速診斷的依據。隨著分子生物學技術發(fā)展，核酸檢測技術逐漸應用到孢子絲菌的分型和檢測中，目前常用的孢子絲菌檢測及分型的靶基因主要有內轉錄間隔區(qū)(internaltranscribed spacer,ITS)、鈣調蛋白(calmodulin,CAL)、延長因子(elongation factors,EF)等，通過設計針對靶基因的特異性引物，擴增獲得長度不同的目的片段，進一步運用瓊脂糖凝膠電泳對其進行區(qū)分，從而對孢子絲菌進行種間鑒定。2015年，Rodrigues【參考文獻：Rodrigues,A.M.et al.2015,9(12),e0004190.】建立了普通單重PCR檢測技術可檢測并區(qū)分球形孢子絲菌、申克孢子絲菌以及巴西孢子絲菌，是目前最靈敏和特異的致病孢子絲菌核酸檢測技術。

目前，臨床上常用的孢子絲菌診斷方法包括直接鏡檢、培養(yǎng)、組織病理檢查等。除培養(yǎng)外，都不能對其鑒定到種水平。由于種間形態(tài)十分相似，常需要經驗豐富的真菌學專家進行鑒定，并且孢子絲菌培養(yǎng)耗時較長，通常需2-4周，不適用于臨床早期診斷。目前常用的分子鑒定手段主要包括對目的片段擴增及測序、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)以及特異性引物普通PCR檢測等。2015年，Rodrigues建立了普通單重PCR檢測技術，可檢測并區(qū)分球形孢子絲菌、申克孢子絲菌以及巴西孢子絲菌，是目前最靈敏和特異的致病性孢子絲菌核酸檢測技術。該方法使用普通PCR技術，檢測的靈敏度和特異性與熒光PCR相比相對較低，對每種致病孢子絲菌均需單獨擴增，并進行凝膠電泳對擴增產物進行鑒定和檢測，總檢測時間至少需要三個小時以上。因此，建立更加靈敏、特異、便捷的區(qū)分不同種致病性孢子絲菌的檢測技術非常必要。