[發(fā)明專利]一種核酸提取擴增檢測試劑盒

有效

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• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109371008B
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 周杰鋒;王德明
• 申請（專利權）人: 寧波艾捷康寧生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/686
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 朱旭雷

本發(fā)明提出一種核酸提取擴增檢測試劑盒，該核酸提取擴增檢測試劑盒由裂解液試劑盒以及PCR管組成。裂解液試劑盒內盛放核酸裂解液，待測樣本加入核酸裂解液之后，通過所述核酸裂解液的作用使病毒核酸釋放出來，并實現(xiàn)純化，樣本加入核酸裂解液之后所得物可以直接加入到PCR管實現(xiàn)PCR檢測。所述PCR管內放置直接用于熒光定量PCR測量的冷凍干粉PCR擴增體系試劑，所述冷凍干粉PCR擴增體系試劑是以PCR反應緩沖液、DNA聚合酶、反應特異性引物、探針以及凍干保護劑為原料通過冷凍干燥工藝制備的所得物。

技術領域

本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種核酸提取擴增檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

實時熒光定量PCR技術已廣泛應用于遺傳病分子診斷、臨床檢驗、動植物進出口檢疫、食品安全監(jiān)測、土壤微生物檢測和親子鑒定等眾多領域。由于血液、食物、土壤等樣本中含有大量抑制因子，如血紅蛋白、高鐵血紅素、乳鐵蛋白、腐植酸等，對常規(guī)Taq DNA聚合酶將產生明顯的抑制作用。因此，必須先從這些待測樣本分離提取核酸，然后用于PCR擴增。核酸提取是核酸檢測第一步，也是分子生物學中關鍵方法之一。為下游核酸檢測提供基礎，提取質量和完整性直接影響臨床研究或診斷。

一般核酸提取過程包括兩步：樣品的裂解和純化。傳統(tǒng)的提取試劑由于取得率相對較低，且步驟較為繁雜，給提取工作帶來一定影響，難以得到合格核酸樣品。磁珠法是近幾年發(fā)展起來的核酸提取方式，提取的核酸純度高、產量大。顯然，傳統(tǒng)方法操作步驟多、成本高、對樣品的需要量較大且易于造成交叉污染，不利于客戶快速提取純化核酸樣本。

另外，在目前核酸檢測應用最廣的實時熒光PCR技術中，試劑大都不是即用型的，造成PCR檢測普遍存在操作復雜、費事、所需費用高等問題，使用前需要有復雜的配置工作，容易造成試驗的誤差甚至失敗。不同人員操作也引起實驗誤差；某些試劑在常溫下保存不穩(wěn)定；不能做到一步法快速提取核酸；PCR檢測試劑需要現(xiàn)場手動配置，多個步驟需要人工標記，各階段的檢測儀器獨立，不利于全自動處理大量試驗樣本。

發(fā)明內容

鑒于上述現(xiàn)有技術中存在的以上缺陷，本發(fā)明提出了一種核酸提取擴增檢測試劑盒及其檢測方法。該核酸提取擴增檢測試劑盒及其檢測方法采用了直接提取并擴增反應檢測臨床樣本中病毒核酸的實時熒光PCR反應體系，將待測樣本加入裂解液實現(xiàn)核酸裂解與純化，裂解純化后的產物可以直接進行PCR檢測，并以即用型的凍干粉試劑實現(xiàn)擴增反應與PCR檢測，無需測前配制，檢測徹底解決了依賴于純化的核酸DNA為模板進行PCR擴增這一瓶頸問題，適用樣本包括血液、血清、血漿、唾液、尿液、組織液、精液、分泌液、膿汁和呼吸液和粘液等多類型樣本。

本發(fā)明提供一種核酸提取擴增檢測試劑盒，其特征在于，包括：裂解液試劑盒以及PCR管，裂解液試劑盒內盛放核酸裂解液，通過所述核酸裂解液的作用使病毒核酸釋放出來；所述PCR管內放置直接用于熒光定量PCR測量的冷凍干粉PCR擴增體系試劑，所述冷凍干粉PCR擴增體系試劑是以PCR反應緩沖液、DNA聚合酶、反應特異性引物、探針以及凍干保護劑為原料通過冷凍干燥工藝制備的所得物。

其中，所述核酸裂解液包括GuHCl、NaOH、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、NaCl、聚乙二醇辛基苯基醚、表面活性劑、苯酚、異戊醇。其中，GuHCl的濃度為5.6-5.85g/10ML；乙二胺四乙酸0.03-0.04g/10ML；三羥甲基氨基甲烷0.06-0.07g/10ML；NaCl 0.01-0.015g/10ML；聚乙二醇辛基苯基醚2％-10％(體積比例)；表面活性劑0.075-0.1％(體積比)；核酸裂解液中加入1％-2.5％(體積比例)的苯酚、異戊醇混合液，其中苯酚、異戊醇體積比20:1-25:1。

所述表面活性劑采用以下任意一種：十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基甲三胺、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸鈉。

其中，所述冷凍干粉PCR擴增體系試劑采用如下方式制備：將PCR反應緩沖液、DNA聚合酶、反應特異性引物、探針與凍干保護劑溶液按照預定比例混合后，冷凍干燥。