[發明專利]一種基于共進化網絡的ω-轉氨酶突變體以及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811230792.6
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109486778B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 黃俊;梅樂和;朱婉麗;呂常江;胡升;趙偉睿;王宏鵬
• 申請（專利權）人: 浙江科技學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/10
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種基于共進化網絡的ω?轉氨酶突變體以及制備方法和應用。該ω?轉氨酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本發明獲得的ω?轉氨酶突變體的半失活溫度為42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期為20.6min和26.0min，比野生型酶延長13.7min和19.1min。本發明利用蛋白質共進化網絡指導ω?轉氨酶的研究，將生物信息學與計算機軟件相結合，預測影響ω?轉氨酶結構和功能作用的重要位點，構建突變文庫，以獲得酶活及熱穩定進一步改善的突變體，有效增加突變成功率，提高篩選工作量，提高實驗效率。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種基于共進化網絡的ω-轉氨酶突變體以及制備方法和應用。

背景技術

轉氨酶是5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate,PLP)依賴性酶，廣泛存在自然界中，能催化氨基由氨基供體向氨基受體的轉移反應，在細胞的氮代謝過程中發揮著重要作用。轉氨酶作為生物催化劑可用于催化制備手性胺類化合物，作為合成治療糖尿病藥物、心血管藥物、神經類藥物、抗高血壓藥物和抗感染藥物的重要中間體。

根據PFAM數據庫中的多序列比對，轉氨酶可以被分為5類：天冬氨酸轉氨酶、芳香族轉氨酶、ω-轉氨酶、支鏈轉氨酶和D-轉氨酶。由于ω-轉氨酶(ω-transaminase，簡稱ω-AT)的底物結合口袋大于天冬氨酸轉氨酶、芳香族轉氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工業應用價值。另外轉氨酶還具有較高區域選擇性和立體選擇性等優點。轉氨酶既可以通過動力學拆分消旋胺，也能通過酮的不對稱合成生成手性胺，比傳統化學催化方法更具有吸引力和競爭力。

來自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-AT能催化(R)-(+)-α-甲基芐胺與酮酸反應生成苯乙酮，手性選擇性為(R)型。ω-轉氨酶的催化過程如下所示：

目前，關于分子改造ω-轉氨酶提高其熱穩定性的研究已有報道。例如：

授權公告號為CN105441404B的發明專利文獻公開了ω-轉氨酶突變體及其編碼基因和制備方法，該發明利用溫度因子結合能量優化策略對野生型ω-轉氨酶進行突變位點預測，進而進行定點突變，篩選得到的突變體的半失活溫度高達40.9℃，比野生型酶提高2.9℃。

申請公布號為CN105950581A的發明專利申請文獻公開了一種引入二硫鍵的ω-轉氨酶突變體及其應用，該發明根據ω-轉氨酶的三維結構模型，分析蛋白質結構中B-factor數據，結合鍵長、鍵角、能量等生物信息學特征，使用生物信息學計算軟件Disulfide byDesign對該酶進行引入二硫鍵的理性設計，選出二硫鍵潛在的引入位點；然后結合相應位點B-factor值，選擇該蛋白的不穩定區域引入二硫鍵，設計定點突變引物，以ω-轉氨酶基因為模板，進行定點突變，PCR擴增、純化后，篩選得到含有一個半胱氨酸的突變體，再以該突變體為模板，進行定點突變得到同時含有兩個半胱氨酸的突變體，轉化至宿主細胞，獲得定點突變文庫；最后從所述定點突變文庫中篩選效果較好的ω-轉氨酶突變體。該方法ω-轉氨酶突變體由土曲霉(Aspergillus terreus)ω-轉氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分別突變為半胱氨酸獲得，該ω-轉氨酶突變體的半失活溫度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期為10.4min，比野生型延長了3.5min，較野生型提高了50.7％，熱穩定性大大提高。

申請公布號為CN107058256A的發明專利申請文獻公開了ω-轉氨酶突變體及其制備方法和應用，該發明依據在自然進化過程中，同源蛋白質的氨基酸序列某些特定位置向蛋白質結構和功能有利的方面趨于一致的機制，利用生物信息學技術篩選出與待改造生物酶同源的序列，并進行序列一致性分析，確定待改造生物酶中與同源序列不一致的氨基酸殘基位點作為突變對象，進而利用定點突變技術進行改造。