[發明專利]用于敲除Egr3基因的腺相關病毒重組載體及其構建方法和用途

在審

• 申請號: 201811203666.1
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109295098A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳意雄;蔡曉龍;鄒杰;朱鵬飛;白易鑫
• 申請（專利權）人: 漢恒生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 常州市權航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 黃晶晶

本發明提供一種用于敲除Egr3基因的腺相關病毒重組載體及其構建方法和用途，載體至少包括：如下可操作性連接的序列元件：5’末端反相重復序列，CMV啟動子，sacas9編碼序列，polyA信號序列，U6啟動子序列，gRNA序列，3’末端反相重復序列。腺相關病毒重組載體載體可以高效的敲除Egr3。經過發明人研究發現，Egr3基因敲除載體可以有效抑制HepG2細胞肝癌模型的移植瘤生長及腫瘤血管生成。說明本發明的技術方案可以適用于肝癌疾病的治療。

技術領域

本發明涉及一種用于敲除Egr3基因的腺相關病毒重組載體及其構建方法和用途，屬于生物技術領域。

背景技術

Egr3屬于Egr(早起生長反應因子)家族成員，屬于轉錄因子家族成員的即可反應因子，主要參與調解細胞的生長、增殖、分化和凋亡過程

腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依賴病毒屬，病毒顆粒大小約為20～26nm，完整的生活周期需要輔助病毒(通常為腺相關病毒或皰疹病毒)參與。它編碼兩個末端的反向重復序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因編碼病毒衣殼蛋白，rep基因參與病毒的復制和整合。AAV有多種血清型，不同血清型對不同組織的親和力不同，適用于各種體內感染實驗。由于AAV的安全性能好和表達時效長的優點，目前已成為最有前景的基因治療工具。

AAV包裝系統分為3質粒，其中包括可以插入外源基因的穿梭質粒，以及編碼rep和cap蛋白編碼基因的pAAV-RC，以及替代腺相關病毒所依賴的腺相關病毒的pHelper質粒。3種質粒共轉染工具細胞AAV-293后，可以形成攜帶有外源插入基因的AAV病毒顆粒。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)是近期出現的一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。在這一系統中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點切斷雙鏈DNA。在基因組編輯過程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條RNA(sgRNA)表達同樣可以起到靶向剪切的作用。

1971年，Judah Folkman博士首次提出了“腫瘤生長依賴于血管生成(tumorangiogenesis)”的觀點：一旦腫瘤發生，任何數量的腫瘤細胞增加，都必將伴有新毛細血管的形成。新生血管通過灌注形式為腫瘤細胞生長提供營養供給,同時它也是腫瘤細胞代謝產物排泄的有效途徑；而在沒有血管形成的情況下，腫瘤的營養供給及代謝物排泄僅能靠簡單的物理彌散。這就是嚴重地限制了腫瘤細胞的生長。

腫瘤的生長和轉移與腫瘤血管有著密切的關系。實體瘤大概在1～2mm大小時無新生血管，供給其生長的營養依賴于周圍組織的彌散作用，生長極緩慢或處于“休眠”狀態。當腫瘤進一步增長時新生血管形成是必要的，癌細胞從供應血管中不斷攝取營養物質與氧，運走代謝產物，滿足腫瘤細胞生長的需要。此時腫瘤的營養供應由彌散變為灌注，該階段腫瘤快速增長并具有轉移能力。目前抑制腫瘤血管的形成可作為腫瘤治療的一種重要手段。

本領域技術人員一直致力于開發能夠有效治療腫瘤的基因技術?，F有技術中問題是缺少有效治療肝癌的基因手段和方法。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種Egr3基因敲除載體及其構建方法和用途。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種用于敲除Egr3基因的腺相關病毒重組載體，所述腺相關病毒載體至少包括如下可操作性連接的序列元件：

5’末端反相重復序列，CMV啟動子，sacas9序列，polyA信號序列，U6啟動子序列，gRNA序列，3’末端反相重復序列。