[發明專利]EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法及檢測產品

在審

• 申請號: 201811190350.3
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109295223A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 趙新泰;王明;潘文健
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6851
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

1.一種EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法，其特征在于：所述檢測體系包括上游引物、下游引物、探針A、探針B、野生型模板和突變型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探針A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人體gDNA，所述突變型模板是酶切后的插入EGFR基因E19del突變片段的突變質粒；

將突變型模板和野生型模板按1:100至1:900的拷貝數比例配制成中突變頻率標準品，采用數字PCR以中突變頻率標準品為模板進行反應，根據反應數據制作數據統計圖，選定野生型的熒光區域和突變型的熒光區域，突變型的熒光區域與野生型的熒光區域中熒光信號拷貝數的比值與標準品理論的突變型模板和野生型模板的拷貝數比例相同；

采用數字PCR以野生型模板為模板進行反應，突變型的熒光區域中出現的熒光信號拷貝數即為該檢測體系的背景閾值。

2.根據權利要求1所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法，其特征在于：將突變型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷貝數比例配制成高突變頻率標準品，采用實時熒光定量PCR以低突變頻率標準品為模板進行反應，根據反應終點熒光值和初始熒光值與探針使用濃度的關系，優化探針A和探針B的使用濃度。

3.根據權利要求2所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法，其特征在于：所述反應終點熒光值和初始熒光值與探針使用濃度的關系是反應終點熒光值與初始熒光值的比值越大，且反應終點熒光值與初始熒光值的差值越大，則探針A和探針B的使用濃度越好。

4.根據權利要求1所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法，其特征在于：將突變型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷貝數比例配制成低突變頻率標準品，采用數字PCR以低突變頻率標準品為模板進行反應，若突變型的熒光區域中出現的熒光信號拷貝數大于所述背景閾值的2.5倍，則該檢測體系的靈敏度達到低突變頻率標準品的拷貝數比例相同的值。

5.根據權利要求1所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法，其特征在于：所述探針A和探針B是MGB探針，所述探針A和探針B的3’端均為NFQ基團。

6.根據權利要求1所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測體系的優化方法，其特征在于：探針B的5’端為VIC基團，所述探針A的5’端為FAM基團。

7.一種采用如權利要求1所述的優化方法優化后的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測產品。

8.根據權利要求7所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測產品，其特征在于：所述上游引物和下游引物在反應體系中的終濃度為900nM，所述探針A和探針B在反應體系中的終濃度為200nM。

9.根據權利要求8所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測產品，其特征在于：所述探針A和探針B是MGB探針，所述探針A和探針B的3’端均為NFQ基團。

10.根據權利要求8所述的EGFR基因E19del突變數字PCR檢測產品，其特征在于：所述探針B的5’端為VIC基團，所述探針A的5’端為FAM基團。