[發(fā)明專利]長鏈非編碼RNA-HOXA-AS2在骨組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811177581.0
• 申請日: 2018-10-10
• 公開（公告）號: CN109136227B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱鑫星;林俊堂;于金金;鐘根深;郭睿;杜江;楊芬
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/6883
• 代理公司: 廣州駿思知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44425
• 代理人: 潘雯瑛

本發(fā)明提供了長鏈非編碼RNA?HOXA?AS2在骨組織損傷修復(fù)中應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)HOXA?AS2能夠顯著促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞中的鈣離子沉積，顯著增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞中的堿性磷酸酶活性，顯著提高間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨分化標(biāo)志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表達(dá)量，并能顯著抑制NF?κB信號的活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細(xì)胞生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，涉及長鏈非編碼RNA-HOXA-AS2在骨組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

骨骼損傷修復(fù)和再生，一直以來都是醫(yī)學(xué)界的一大難題。對于運(yùn)動性的骨骼損傷，醫(yī)學(xué)界常常采用自體骨移植、同種異體骨移植、帶血供的游離骨移植以及生物材料替代等傳統(tǒng)方法進(jìn)行治療，但這些方法存在來源少、并發(fā)癥多、免疫排斥以及醫(yī)源性感染等諸多問題，治療效果并理想。隨著骨組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸開始運(yùn)用組織工程的方法，來解決骨組織損傷修復(fù)的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞作為一類具有良好增值能力以及多向分化潛能的種子細(xì)胞，走進(jìn)了人們的視野。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以從骨髓、脂肪等多種組織中分離獲取；在特定的條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞還可以分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞；此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還具有很低的免疫原性。這些特有的特性使得間充質(zhì)干細(xì)胞成為了臨床上骨組織損傷修復(fù)和再生的種子細(xì)胞。大量研究證據(jù)表明：間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，在分子水平上受到多種調(diào)控因子的影響，其中包括一些重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，例如RUNX2和SP7等，它們能夠通過調(diào)節(jié)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控干細(xì)胞的成骨分化，此外，還有很多非編碼RNA也參與了干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用。

長鏈非編碼RNA是一類非編碼蛋白并且長度一般來說大于200個核苷酸的小分子RNA，其表達(dá)量往往偏低并且具有組織特異性。由于長鏈非編碼RNA的低表達(dá)量，人們往往忽略了這類RNA分子在生物學(xué)功能上的重要性。近年來，由于高通量測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA在細(xì)胞凋亡、增殖、分化等多種生物學(xué)過程中都具有非常重要的調(diào)控功能。例如，近來人們發(fā)現(xiàn)了一個長鏈非編碼RNA，稱為PU.1-AS，它可以通過阻斷PU.1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。再如另一個長鏈非編碼RNA，稱為ANCR，它可以通過調(diào)節(jié)RUNX2基因的表達(dá)，來調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。這些研究表明，長鏈非編碼RNA在干細(xì)胞向特定的細(xì)胞方向分化的過程中有著重要的調(diào)控作用。因此，通過改變細(xì)胞中某些重要的長鏈非編碼RNA的表達(dá)量，能夠達(dá)到誘導(dǎo)干細(xì)胞向特定方向分化的目的，從而為組織損傷修復(fù)等醫(yī)學(xué)難題找到新的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的在于，提供長鏈非編碼RNA-HOXA-AS2在骨組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供長鏈非編碼RNA-HOXA-AS2在骨組織損傷修復(fù)檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

長鏈非編碼RNA-HOXA-AS2在骨組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用，所述長鏈非編碼RNA-HOXA-AS2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

一種用于骨組織損傷修復(fù)的過表達(dá)載體pLV-HOXA-AS2，其由HOXA-AS2基因片段與慢病毒空載體pLV構(gòu)建而成；所述HOXA-AS2基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述慢病毒空載體pLV的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

所述過表達(dá)載體pLV-HOXA-AS2的構(gòu)建方法，包括以下步驟：采用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I分別對慢病毒載體pLV以及HOXA-AS2基因片段進(jìn)行雙酶切，并采用T4 DNA連接酶體系對酶切后的HOXA-AS2基因片段以及線性慢病毒載體pLV進(jìn)行連接反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落，提取陽性菌落的質(zhì)粒，得到所述的過表達(dá)載體pLV-HOXA-AS2。