[發明專利]一種檢測鮑曼不動桿菌的試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201811152404.7
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN109666749A
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 謝軼;賴紅錦;嚴淳議;巫麗娟;戴仲秋
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了一種用于鮑曼不動桿菌檢測的試劑盒，它利用交叉引物恒溫擴增技術(Cross?Priming Amplification,CPA)，在固定溫度下實現鮑曼不動桿菌的檢測，免去了對溫度程序化控制的依賴，不需要昂貴的PCR儀，因此大大降低了檢測成本。本發明提供的檢測方法可以準確而低成本地檢測出鮑曼不動桿菌的存在，適合在醫院推廣。

技術領域

本發明涉及醫學檢測領域，尤其涉及一種鮑曼不動桿菌的檢測方法。

背景知識

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是醫院感染的重要病原體。由于它攜帶多個耐藥基因的移動元件，可快速獲得多重耐藥，它的感染率、耐藥率及臨床致死率正在日益上升。在各醫院普及鮑曼不動桿菌的檢測已迫在眉睫。

目前檢測鮑曼不動桿菌的檢測思路多為基因檢測，具體的方法為常規聚合酶鏈式反應(PCR)或熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)。PCR需要用到昂貴的PCR儀，對一些條件有限的醫療機構來說很難實現。qPCR用到的PCR儀比普通的PCR儀更昂貴，成本更高，更難普及。

交叉引物恒溫擴增技術(Cross-Priming Amplification,CPA)是一種恒溫條件下的DNA擴增技術。它基于一種特殊的具有鏈置換活性的酶，Bst DNA聚合酶，通過5-6條特殊的引物，可在恒溫條件快速完成擴增，免去了PCR儀的成本。其檢測可以不依賴有毒核酸染料，操作更加方便安全。但是目前還沒有將CPA技術應用于鮑曼不動桿菌的檢測。

基于CPA技術的分子檢測手段，需要針對一段短至150-200bp的DNA序列設計一組CPA引物(一組引物5-6條，缺一不可)，對于目標DNA序列的堿基組成和理化特性(G/C堿基比例，各條引物退火溫度等)要求極高，CPA引物設計難度極大，這是目前尚沒有CPA技術用于鮑曼不動桿菌的檢測的主要原因。

發明內容

為了解決上述問題，本發明以鮑曼不動桿菌OXA-23基因中一段長193bp的序列為靶點，提供了一種利用CPA技術檢測鮑曼不動桿菌的方法。

本發明提供了一組引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示；

其中，SEQ ID NO.1名為F3，SEQ ID NO.2名為B3，SEQ ID NO.3名為CPR，SEQ IDNO.4名為DF5F，SEQ ID NO.1名為DF5B。

本發明還提供了一種用于檢測鮑曼不動桿菌的試劑盒，其特征在于：它包括SEQID NO.1-5所示的5條引物、Bst DNA聚合酶和對應的緩沖液。

本發明還提供了一種檢測鮑曼不動桿菌的方法，其特征在于：它是采用前述試劑盒檢測。

前述方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)提取樣本DNA：取待檢樣品，提取其中的DNA；

(2)恒溫擴增：用前述的試劑盒對待檢樣本和鮑曼不動桿菌DNA進行擴增；

(3)結果檢測：對DNA擴增結果進行檢測；

(4)結果判讀：出現與鮑曼不動桿菌DNA擴增條帶一致的條帶，則判斷樣本為陽性。

前述方法，其特征在于：步驟(2)中的恒溫擴增的溫度為48-54℃。

進一步地，前述方法，其特征在于：步驟(2)中的恒溫擴增的溫度為50-52℃。

進一步地，前述方法，其特征在于：步驟(2)各引物濃度為：F3 0.25μM，B3 0.25μM，DF5F 0.4μM，DF5B 0.35μM，CPR 0.25μM。

進一步地，前述方法，其特征在于：步驟(2)中反應時間為40-80min。