[發明專利]重組型疫苗宿主蛋白抗體的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201811151989.0
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN109384832B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 顧美榮;李國順;張改梅;陳磊;趙麗麗;郭林;肖海峰;劉司航;肖霞;劉建凱;鄭海發
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/085
• 分類號: C07K14/085;C07K16/10;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K16/06;C12N15/41;C12N15/81;G01N33/569
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明提供重組型疫苗宿主蛋白抗體的制備方法及其應用，先將用于制備重組型疫苗的不攜帶任何外源基因的表達載體導入到與制備所述重組型疫苗所用的完全相同的原核或真核宿主細胞內，構建轉化體，培養擴繁這些轉化體，并按照與制備所述重組型疫苗所采用的完全相同的方法提取、純化得到重組型疫苗宿主蛋白；然后經動物免疫再經抗體純化后制得重組型疫苗宿主蛋白抗體。本發明提供的抗體可應用于重組手足口病疫苗中宿主蛋白殘留檢測，不僅靈敏度高、重復性好、專屬性好，而且適用于一些由漢遜酵母表達的生物制品的宿主蛋白殘留的檢測，因此應用前景十分廣闊。

技術領域

本發明涉及疫苗質控方法，具體地說，涉及重組型疫苗宿主蛋白抗體的制備方法及其應用。

背景技術

重組手足口病疫苗是應用漢遜酵母表達系統研制的一種基因工程產品，主要用于預防嬰幼兒的手足口病。在基因工程產品中殘留的宿主細胞蛋白是影響制品純度的重要因素，反復使用含有宿主細胞蛋白的制品有可能引起接種副反應，并且影響藥物的療效。宿主蛋白(Host cell protein，HCP)成分復雜，種類繁多，且會因生產工藝及純化工藝的不同而發生變化。HCP在生物制品中的殘留量反映的不僅是制品批間的一致性，而且還是衡量生物制品質量的一個重要指標。因此，為了充分保證疫苗的安全有效，開發靈敏度高、適用性好、重復性好的宿主蛋白檢測方法至關重要。

目前，酵母宿主蛋白檢測方法主要有酶聯免疫法(ELISA)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細管電泳(CE)、等電聚焦(IEF)和高效液相層析(HPLC)等。《中國藥典》三部(2015版)中宿主蛋白殘留量檢測方法采用酶聯免疫法(ELISA)。ELISA檢測方法中所用的抗宿主蛋白抗體通常是將宿主細胞破碎后，經過初步處理得到宿主蛋白，免疫動物后獲得。宿主細胞破碎方法包括：有機試劑裂解；溶菌酶等酶類的酶促反應；超聲、高壓勻漿等物理破碎。初步處理方式包括：固液分離；超濾濃縮等。

常規的酵母HCP抗體制備方法，由于HCP分子量大小不一，成分復雜，各成分之間含量、免疫原性差異大，而不容易得到充分反映產品HCP殘留的合適HCP抗體。這是因為，常規方法將酵母HCP全部成分免疫動物之后，獲得抗體主要結合含量高、分子量大且免疫原性強的HCP成分，對于低含量、分子量小且免疫原性弱的HCP成分無結合能力。使用這種制備方法產生的抗體，會導致在通過ELISA(酶聯免疫法)檢測生物制品中HCP殘留時靈敏度大大降低，并且由于部分低免疫原性的HCP成分無法檢測而造成實際測定值偏低，不能充分反映出產品HCP的實際殘留情況。

發明內容

本發明的目的是提供重組型疫苗宿主蛋白抗體(特別是重組手足口病疫苗宿主蛋白抗體)的制備方法及其應用。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供重組型疫苗宿主蛋白的制備方法，將用于制備重組型疫苗的不攜帶任何外源基因的表達載體導入到與制備所述重組型疫苗所用的完全相同的原核或真核宿主細胞內，構建轉化體，然后培養擴繁這些轉化體，并按照與制備所述重組型疫苗所采用的完全相同的方法提取、純化蛋白，即得重組型疫苗宿主蛋白。

本發明中，所述重組型疫苗利用DNA重組技術制備得到，選定病原體編碼有效抗原的基因片段，將該基因片段與載體重組后導入原核或真核宿主細胞內，通過培養擴繁這些轉化體，從細胞培養物中提取、純化目的蛋白，即為重組型疫苗。

所述重組型疫苗包括但不限于重組手足口病疫苗，包括重組EV71疫苗、重組CA6疫苗、重組CA10疫苗、重組CA16疫苗、重組CB3疫苗、重組CB5疫苗、重組E30疫苗。

本發明中，制備重組手足口病疫苗所使用的宿主細胞為酵母菌，優選多型漢遜酵母，更優選尿嘧啶缺陷型漢遜酵母AU-0501；和/或

本發明中，制備重組手足口病疫苗所使用的表達載體為含有甲醇氧化酶啟動子或甲醛脫氫酶啟動子的表達載體，優選為含有甲醇氧化酶啟動子的表達載體PMV-05。