[發明專利]重組型疫苗宿主蛋白抗體的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201811151989.0
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN109384832B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 顧美榮;李國順;張改梅;陳磊;趙麗麗;郭林;肖海峰;劉司航;肖霞;劉建凱;鄭海發
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/085
• 分類號: C07K14/085;C07K16/10;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K16/06;C12N15/41;C12N15/81;G01N33/569
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.重組手足口病疫苗宿主蛋白抗體，其特征在于，其制備方法包括以下步驟：

A、漢遜酵母空載體表達菌株的構建

將漢遜酵母表達載體PMV-05通過電轉化法轉化漢遜酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌AU-0501，經穩定化培養篩選獲得重組漢遜酵母空載體表達菌株；

B、漢遜酵母HCP的制備

B 1、重組漢遜酵母空載體表達菌株發酵培養

將重組漢遜酵母空載體表達菌株接種到100ml一級種子培養基中，在33℃，200rpm搖床振蕩培養20～24小時；然后全量接種于1000ml二級種子培養基中，在33℃，200rpm搖床振蕩培養20～24小時之后全量接種至30L發酵罐中，其中裝有12L發酵培養基，氨水調節發酵液pH值維持在5.0，發酵溫度為30℃，轉速控制在350-750rpm，空氣流速0.5-1.0m³/h，高密度發酵需要純氧補充，溶氧控制在20-60％，20～24h時發酵培養基中碳源耗盡，補加甘油共計2.0L，分5次補加0.40L/次，每次碳源耗盡，溶氧上升時補加甘油，菌體生長共計36～39h，濕菌重最高可達0.3～0.4g/ml；去阻遏階段：轉速750rpm，空氣流速1.0m³/h，溶氧控制在20～60％，加入1L甘油和甲醇混合液進行去阻遏培養，36～54h之間；誘導階段：54～96h之間進行甲醇誘導，溶氧維持在20～40％；發酵結束：92～96h時，待甲醇消耗完全，溶氧上升至80％以上，降溫至20℃開始下罐發酵結束，6500rpm離心15min，收獲發酵菌體；

其中，一級種子培養基：酵母提取物6.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L；

二級種子培養基：酵母提取物6.7g/L，硫酸銨5g/L，甘油20g/L；

發酵培養基：甘油23.333g/L、磷酸二氫銨11.667g/L、3.333g/L氯化鉀、氯化鈣2.500g/L、氯化鈉0.333g/L、硫酸鎂2.500g/L、乙二胺四乙酸鈉0.167g/L；

甘油和甲醇混合液：甘油200ml，甲醇800ml；

B2、漢遜酵母HCP純化

將發酵培養菌體用細胞裂解緩沖液重懸，使用高壓勻漿機在壓力1200bar的條件下破碎細胞2次；

將破碎后的細胞液倒入離心筒中，進行7000rpm離心50min，收集上清液，將收集的上清液中加入硫酸銨濃度至終濃度為30％；

將硫酸銨沉淀產物采用9000rpm離心50min，收集沉淀，并加入復溶緩沖液，攪拌40min，9000rpm離心50min，收集復溶上清液；

將復溶上清液以300KD的膜采用50mM Tris pH8.0進行超濾，收集超濾液；

將超濾液進行離子交換層析，以Capto Q為層析介質，采用50mM Tris pH8.0平衡8個柱體積后上樣，采用洗脫液洗脫，收集UV280nm紫外吸收峰，并經0.22μm的除菌過濾器無菌過濾后即得漢遜酵母HCP；

其中，復溶緩沖液：20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.2；

洗脫液：含有300mM NaCl的50mM Tris溶液；

C、漢遜酵母HCP抗體的制備

C1、兔子免疫

第一次免疫：取6ml稀釋至1mg/ml的步驟B獲得的宿主蛋白，加入6ml弗氏完全佐劑進行乳化，取一滴至水面不散開為乳化完全；用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑乳化液2ml，乳化液中含1mg宿主蛋白，在頸部和背部皮下多點分別注入0.2mL；

第二次免疫：間隔10-14天后，進行二免；取6ml稀釋至0.5mg/mL的宿主蛋白，加入弗氏不完全佐劑6ml乳化，取一滴至水面不散開為乳化完全；用2ml注射器吸取弗氏不完全佐劑乳化液2ml，乳化液中含0.5mg宿主蛋白，在頸部和背部皮下多點分別注入0.2mL；

第三次免疫：間隔10-14天后，進行三免，方法同第二次免疫；

第四次免疫：間隔10-14天后，進行四免，取6ml稀釋至0.5mg/mL的宿主蛋白過濾，通過耳緣靜脈注射1ml；

采血：四免14天后用心臟采血法采血；分離血清，分裝后貯于-80℃以下冰箱保存，并測定血清效價；

C2、兔血清多抗純化

層析柱：柱體積，即CV，為1ml，介質：GErProtein A FF；

樣品處理：取血清7.5ml采用平衡液3倍稀釋，0.45μm濾器過濾純化備用；

層析柱處理：采用平衡液處理5～10個CV，1ml/min；

上樣：上樣量20ml，采用平衡液處理5～10個CV，1ml/min；

洗脫：在收集管中預先加入1ml中和液，收集洗脫產物；

柱再生：采用0.1M NaOH洗雜2～5個CV，水洗10個CV，20％乙醇10個CV保存；

其中，平衡液的配方為：磷酸氫二鈉1.392g/L，一水磷酸二氫鈉1.224g/L，氯化鈉8.766g/L；中和液為1M Tris pH 9.0；

C3、抗體標記

稱取20mg HRP溶解于5ml蒸餾水中；于上液中加入1ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋中，對1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；加200μl 0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入40mg步驟C2制備得到的IgG，在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時；加0.5ml新配的4mg/mlNaBH₄液，混勻，再置4℃2小時；將上述液裝入透析袋中，對0.15M pH7.4PBS透析，4℃過夜；在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時；3000rpm離心半小時，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中；將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M pH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，按照1:1的體積加入甘油，分裝后冰凍保存，并測定效價。

2.重組手足口病疫苗宿主蛋白檢測試劑或試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑或試劑盒的有效成分為權利要求1所述的重組手足口病疫苗宿主蛋白抗體。