[發明專利]一種提取長根菇基因組DNA的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201811102162.0
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN109055362A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 劉朋虎;張煜隆;黃在興;胡應平;羅海凌;蘇德偉;李晶;翁伯琦;林占熺
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種提取長根菇基因組DNA的試劑盒及方法。該劑盒的組成包括：（1）平衡液：1%Na₂SiO₃·9H₂O，1%NaOH；（2）裂解液：5.0M鹽酸胍，25%異丙醇和1%PVP K30；（3）洗滌液：20mM NaCl，20 mM Tris?HCl，85%乙醇，pH7.5；（4）洗脫液：10mM Tris?HCl，pH8.5；（5）DNA吸附柱。本發明提取長根菇基因組DNA的試劑無苯酚、氯仿等有毒物質，更安全；提取方法簡便、高效，提取時間縮短至15min；提取產物純度高、完整性好，能夠直接用于分子生物學和遺傳學研究。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種提取長根菇基因組DNA的試劑盒及方法。

背景技術

DNA是生命體中遺傳信息的載體，包含了生物體的遺傳性狀。高質量、高純度的總DNA是保證開展PCR擴增、限制性內切酶酶切、遺傳圖譜分析、分子雜交、遺傳多樣性分析以及基因組學等分子生物學研究的首要條件。因此，高效、快速制備高純度、完整性好的總DNA樣品顯得極為重要。

目前，傳統制備真菌總DNA的方法包括CTAB法、SDS法、堿裂解法和常規試劑盒方法等，CTAB法和SDS法采用離子型表面活性劑用于裂解真菌細胞，使基因組釋放出來，再通過苯酚/氯仿/異戊醇等的多次抽提使蛋白質等沉淀于有機試劑中，最后經過異丙醇或者乙醇沉淀得到純度高、完整性好的DNA分子。在這兩種方法中存在反復離心、沉淀、等待的工序，操作繁瑣且耗時長，其提取過程需要2-3 h；且藥品中苯酚、氯仿和異戊醇等有機溶劑具有毒性，對操作人員可能造成一定傷害；其次可能導致有機溶劑殘留在總DNA樣品中從而造成下游試驗無法順利進行。

常規試劑盒方法是在CTAB法、SDS法等常規方法等基礎上結合DNA吸附柱進行優化，解決了DNA樣品沉淀時間長和樣品純度低的缺點，且整個實驗過程縮短到1h左右。但是，常規試劑盒方法提取過程中依然需要涉及氯仿、苯酚、β-巰基乙醇等有毒試劑。

堿裂解法直接利用強堿NaOH溶液使細胞膜溶解，蛋白變性，釋放基因組DNA，再經過TE緩沖液對堿溶液稀釋中和，從而得到了DNA溶液直接用于PCR擴增，是目前最為常見的快速簡便提取基因組DNA的方法。該方法得到的DNA由于不經過任何純化處理，含有大量色素、多糖和蛋白等物質，其含量和純度都低，不利于后續實驗，且反應過程中強堿NaOH會打斷DNA片段，導致該方法獲得的DNA樣品擴增上限僅為1000 bp左右的基因，但對于較長的基因片段而言，這種提取方法顯然不適用。

長根菇（Oudemansiella radicata），又稱小奧德蘑、長根金錢菌，商品名黑皮雞 ，自然界主要分布在北溫帶地區，亞熱帶地區也有分布，熱帶地區罕見分布，是食用菌中的上品，肉質細嫩，柄脆可口，富含蛋白質、氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素等多種營養成分，食用價值高。菇中富含長根素，有強烈的降血壓作用，產品在北京、上海、廣州、深圳等大城市廣受歡迎。隨著現代生物技術的發展，長根菇分子生物學的研究也逐步深入，但由于長根菇子實體中含有大量黏性的多糖類物質等干擾，因此目前長根菇基因組DNA的提取方法有的操作復雜用時長，有的用到苯酚、氯仿、巰基乙醇等有毒物質，有的DNA完整度差。因此，針對以上不足并通過對現有提取技術的改進發明了本方法，具有安全、快速、簡便、高效、產物完整度高、經濟等優點。

發明內容